本发明属于寄生虫检测，具体涉及一种球虫单个卵囊全基因组dna扩增和基因组测序的方法。
背景技术：
1、球虫（coccidia）是属于顶复门、孢子纲的专性细胞内寄生原虫，至今为止，鉴定出约有2000种球虫种类。球虫常为混合感染且无法体外纯培养，仅能通过建立动物模型获得大量纯种卵囊。然而国内外，只有鸡和兔球虫的动物模型建立成功，其余约1900多种球虫无法获得纯种卵囊。其次，球虫卵囊壁粘连宿主肠道食物残渣及细菌，影响后续基因组组装。最后，球虫基因组具有大量的重复序列（cag和aaaccct/agggttt），增加球虫基因组组装的困难。迄今为止，只有部分动物模型建立成功可获得大量纯种卵囊的球虫进行了第三代和第二代全基因组测序，其余1900多种球虫基因组处于空白。
2、现有技术使用1×108个卵囊提取卵囊全基因组dna后进行基因组测序，卵囊数量巨大，对于约1900多种无法建立动物模型的球虫物种，无法获得大量纯种卵囊。动物模型建立费时费力，且长期的动物模型传代会引起基因突变。卵囊壁会粘连细菌和真菌等微生物，大量的卵囊使得真菌细菌等微生物的数量增加，从而引起原始数据污染严重影响后续基因组组装。
3、由于通过全基因组扩增技术可对非常微量的dna进行扩增获得大量dna，故被认为是目前突破球虫基因组学研究困境的一种可行方法。现有技术（cryptosporidium as atestbed for single cell genom）公开了一种以隐孢子虫为例的单细胞全基因组扩增和测序流程，在整个单细胞基因组学工艺流程中，采用磁珠破碎法对卵囊进行破壁，从分选的单细胞中挑选出十个扩增基因组进行基因组测序，但单细胞基因组的覆盖率仅达到了81%，并且通过结合10个单细胞基因组，才能够得到全基因组。
4、迄今为止，球虫卵囊基因组dna的提取方法过程中均需使用物理方法和化学试剂破壁，由于球虫具有2-3层卵囊壁，因为常规的化学试剂无法破碎卵囊壁，常需要联合物理方法。目前常用的磁珠破碎法、超声波破碎法和反复冻融均对球虫dna链有一定的破坏，在基因组测序过程中容易形成嵌合体以及增多重复序列出现的频率，因此在球虫全基因组dna提取过程中需要在不损伤球虫dna链的情况下破壁方法。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题：现有技术中，针对无法获得大量纯种卵囊的球虫，dna质量达不到第三代测序要求，组装水平并未达到染色体水平且完整度不高。为解决上述技术问题，提供一种球虫单个卵囊全基因组dna扩增和基因组测序的方法
2、本发明的技术方案具体如下：
3、一种球虫单个卵囊全基因组dna扩增和基因组测序的方法，所述方法包括下列步骤：
4、s1）纯化球虫卵囊：取感染球虫的动物粪便，基于饱和盐水漂浮法和氯化铯梯度离心法进行球虫卵囊纯化，得到球虫卵囊液；
5、s2）单卵囊分离及卵囊壁破碎：将纯化后的球虫卵囊液置于显微镜下，根据球虫形态结构确认目标球虫卵囊，使用毛细管针分离目标球虫卵囊，使用pbs缓冲液冲洗后并置于新的缓冲液中，在显微镜下使用毛细管针轻轻戳卵囊壁使其破壁，得到破碎的卵囊壁和释放出的4个孢子囊；使用毛细管针分离4个孢子囊并置于pbs缓冲液中；
6、s3）球虫全基因组dna扩增：使用单细胞全基因扩增方法对步骤s2）得到的4个孢子囊样品进行裂解及全基因组扩增，获得球虫全基因组dna样本；
7、s4）全基因组扩增产物纯化：使用商业化试剂agcourt ampure xp对步骤s3）中获得的球虫全基因组dna样本进行磁珠纯化，得到纯化后的dna样本；
8、s5）wga产物检测：对步骤s4）中纯化后的dna样本采用0.8%琼脂糖凝胶脉冲电泳检测，确定扩增是否成功；
9、使用nanodrop one检测样品浓度c、a260/a280及a260/a230；
10、使用qubit对wga产物进行定量，并根据两种仪器检测的浓度计算nc/qc值；
11、取1ul步骤s4）中纯化后的dna样本用双蒸水按照1:100稀释，利用荧光定量pcr仪基于球虫ssu rrna基因检测稀释液中球虫基因组dna的含量；以反应测得的ct值表征稀释液中柔嫩艾美耳球虫基因组dna的含量；
12、s6）高通量测序分析：对步骤s4）中纯化后dna进行高通量文库构建及第三代pacbio revio hifi平台测序，测序数据使用blastn与nt库进行比对，去除污染及接头序列；使用flye软件和ragoo软件进行基因组组装，获得最终的基因组组装结果，并使用busco软件基于coccidia_odb10数据库评估其完整性；通过mcscanx软件将球虫基因组与参考基因组进行共线性分析。
13、所述步骤s3）中单细胞全基因扩增方法为多重置换扩增。
14、所述球虫为柔嫩艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、牛艾美耳球虫、柱状艾美耳球虫、阿拉巴艾美耳球虫、拔克郎艾美耳球虫、亚球艾美耳球虫、奥博艾美耳球虫、椭圆艾美耳球虫、加拿大艾美耳球虫、巴西艾美耳球虫和皮利他艾美耳球虫中的任意一种。
15、所述显微镜为生物显微镜。
16、所述毛细管针的针头孔径为30~40μm。
17、有益效果：
18、本发明利用显微镜和毛细管针精准地分离出单个球虫卵囊，保证了卵囊的纯度；在显微镜下，利用毛细管针刺破球虫卵囊壁，释放出四个孢子囊，未对球虫dna链造成损伤；经过全基因组扩增获得高质量的扩增基因组，达到第二代及第三代测序要求，球虫基因组达到染色体草图级别且完整度在90%以上。
1.一种球虫单个卵囊全基因组dna扩增和基因组测序的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s3）中单细胞全基因扩增方法为多重置换扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球虫为柔嫩艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫、牛艾美耳球虫、柱状艾美耳球虫、阿拉巴艾美耳球虫、拔克郎艾美耳球虫、亚球艾美耳球虫、奥博艾美耳球虫、椭圆艾美耳球虫、加拿大艾美耳球虫、巴西艾美耳球虫和皮利他艾美耳球虫中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显微镜为生物显微镜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛细管针的针头孔径为30~40μm。
