本发明属于细胞培养，具体涉及一种中国花鲈肾脏细胞系及其建立方法与应用。
背景技术：
1、中国花鲈(lateolabrax maculatus)属鲈形目，鮨科，花鲈属。俗称鲈鱼、花寨、板鲈、鲈板。分布于中国、朝鲜及日本的近岸浅海，中国沿海均有分布，此鱼喜栖息于河口或淡水处，亦可进入江河淡水区，属名贵鱼类，是我国沿海重要的养殖物种。花鲈在海水养殖鱼类中产量始终名列前茅，2010年以来，我国花鲈每年养殖产量均超过10万吨，约为日本和韩国鲈鱼养殖产量总和，年总产值超过30亿元。
2、与活体动物实验相比，细胞模型具有实验周期短、费用少、避免牺牲活体动物等优点。不同鱼类的细胞系已被用作病毒学研究的重要体外模型。一般来说，细胞系通常被用作分离病毒和验证病毒与宿主相互作用的工具，在病毒学领域已被广泛采用。
3、威胁到中国花鲈鱼这种重要养殖物种产量的有多种流行病毒病，开展活体实验细胞系是用于研究鱼类免疫学和毒理学的有力工具，也是用于相关病毒分离鉴定、疫苗研制的必要材料。为了能够进一步解决病毒病流行的问题，制备出一株能够应用于细胞实验的中国花鲈细胞系非常重要。
4、目前中国花鲈肾脏细胞原代培养还未见报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种中国花鲈肾组织细胞原代培养方法，本发明使用酶消化法进行中国花鲈肾组织细胞原代培养，建立中国花鲈肾组织细胞原代培养方法，并对比多种培养条件，确定最佳培养条件，并基于该细胞系进行鱼类病毒疫苗、药物的开发。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种中国花鲈肾脏细胞系。
3、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的中国花鲈肾脏细胞系的构建方法。
4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的中国花鲈肾脏细胞系的应用。
5、本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
6、本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。
7、本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。
8、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：
9、本发明的第一个方面，提供一种中国花鲈肾脏细胞系，名称为花鲈肾细胞lmklateolabrax maculatus，于2024年4月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2024100。
10、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的中国花鲈肾脏细胞系的构建方法，包括以下步骤：
11、1)将中国花鲈的肾脏组织消毒，剪碎成组织块；
12、2)使用蛋白酶消化所述组织块，固液分离，将细胞沉淀置于第一培养基中培养，传代；
13、3)传代培养至8～12代时，使用第二培养基进行传代培养；
14、4)传代培养至18～22代时，使用第三培养基进行传代培养，得到中国花鲈肾脏细胞系。
15、在本发明的一个实施例中，步骤1)中所述中国花鲈的肾脏组织的制备方法如下：冰冻麻醉中国花鲈幼鱼，使用75％酒精对鱼体进行浸泡消毒，无菌条件下解剖分离中国花鲈鱼肾脏组织，去除肾脏表面的脂肪等结缔组织。
16、在本发明的一个实施例中，步骤1)中所述中国花鲈的肾脏组织的消毒方法如下：用含200iu/ml青霉素和200μg/ml链霉素的磷酸盐缓冲盐水洗涤6次。
17、优选地，步骤1)中所述组织块的大小为1～3cm3/个。
18、优选地，步骤2)中蛋白酶包括胰蛋白酶。
19、优选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.2～0.3wt％。
20、优选地，所述消化的条件为25～29℃下消化30～60分钟。
21、优选地，所述第一培养基包括青霉素、链霉素、硫酸软骨素、bfgf、igf-1、血清和基础培养基。
22、优选地，所述青霉素的终浓度为50～150iu/ml。
23、优选地，所述链霉素的终浓度为50～150μg/ml。
24、优选地，所述硫酸软骨素的终浓度为15～25μg/ml。
25、优选地，所述bfgf的终浓度为2.5～7.5ng/ml。
26、优选地，所述igf-1的终浓度为20～60ng/ml。
27、优选地，所述血清的体积分数为18～22％。
28、优选地，所述第二培养基包括硫酸软骨素、bfgf、igf-1、血清和基础培养基。
29、优选地，所述硫酸软骨素的终浓度为15～25μg/ml。
30、优选地，所述bfgf的终浓度为2.5～7.5ng/ml。
31、优选地，所述igf-1的终浓度为20～60ng/ml。
32、优选地，所述血清的体积分数为13～17％。
33、优选地，所述第三培养基包括血清、和基础培养基。
34、所述血清的体积分数为8～12％。
35、优选地，所述血清包括胎牛血清。
36、优选地，所述基础培养基包括m199、l-15、dmem或dmem/f12中的至少一种。
37、优选地，所述培养的条件为25～29℃，4～6％co2。
38、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的中国花鲈肾脏细胞系在1)～8)中任一项中的应用：
39、1)培养病毒；
40、2)制备培养病毒的产品；
41、3)分离病毒；
42、4)制备分离病毒的产品；
43、5)非诊断治疗目的地检测病毒；
44、6)制备检测病毒的产品；
45、7)制备病毒疫苗；
46、8)药物筛选。
47、优选地，所述药物为用于预防、治疗病毒感染所致疾病的药物。
48、优选地，所述病毒为鳜蛙病毒、传染性肾坏死病毒、鳜弹状病毒、神经坏死病毒中的至少一种。
49、本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系中，培养。
50、优选地，所述病毒为鳜蛙病毒、传染性肾坏死病毒、鳜弹状病毒、神经坏死病毒中的至少一种。
51、优选地，所述培养的条件为25～29℃，4～6％co2。
52、本发明的第五个方面，提供一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗。
53、优选地，所述病毒为鳜蛙病毒、传染性肾坏死病毒、鳜弹状病毒、神经坏死病毒中的至少一种。
54、优选地，所述培养的条件为25～29℃，4～6％co2。
55、本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五个方面的方法制备得到。
56、本发明的有益效果是：
57、本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次构建得到一种中国花鲈肾脏细胞系，名称为花鲈肾细胞lmk，于2024年4月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2024100。本发明方法原代细胞培养操作简单可行，重复性强，细胞状态好，增殖能力强，短期内获得大量细胞并能传代。本发明方法得到的中国花鲈鱼肾脏原代细胞对海鲈重大病毒病病原敏感，对鳜蛙病毒(mandarin fishranavirus，mrv)、传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosisvirus,isknv)、鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus，scrv)敏感，表现为对比未感染病毒的对照组，在攻毒一周内细胞出现明显病变，可以为鲈鱼感染mrv、isknv、scrv的相关研究提供细胞材料；为其水产病毒学、水产免疫学等领域的深入研究提供了强力支撑。本发明的方法为开展中国花鲈鱼各方面研究提供了的重要基础，尤其为研究病毒性疾病及其食性分子机制提供了良好的素材，可助推水产养殖产业的健康快速发展，同时为鱼类组织细胞原代培养和建系提供重要参考。
1.一种中国花鲈肾脏细胞系，名称为花鲈肾细胞lmk，于2024年4月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2024100。
2.权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
6.权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系在1)～8)中任一项中的应用：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
8.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系中，培养；
9.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的中国花鲈肾脏细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗；
10.一种病毒疫苗，通过权利要求9所述的方法制备得到。
