本发明属于生物医药，具体涉及一种结直肠癌肝转移肿瘤靶向抗体及其应用。
背景技术：
1、结直肠癌 (colorectal cancer, crc) 是全球癌症相关死亡的第四大原因。结直肠癌肝转移 (colorectal cancer liver metastasis ，crlm)发生在近 50% 的 crc 患者中，在结直肠癌死亡人数占比高达 70% 以上。虽然手术是肝转移的治愈性方法，但超过50%的患者在2年内出现复发。目前，越来越多的免疫疗法，如免疫检查点阻断（icb），已经改写了不同类型癌症的治疗方案，然而，免疫治疗在 crlm 中的效益有限。因此，深入剖析转移微环境可能为 crlm 的免疫疗法提供新的见解。
2、三级淋巴结构 (tls) 是异位淋巴滤泡，主要由髓系细胞、t 细胞和 b 细胞组成。最近的研究表明，tls 可能通过调节肿瘤微环境(tme)发挥关键作用，这与各种实体瘤的免疫治疗良好响应以及总体生存率(os)提高密切相关，如黑色素瘤、软组织肉瘤和乳腺癌。但tls 的分布和组成在不同癌症中有所不同，从而导致不同的临床结局。例如，在肝细胞癌和肝内胆管癌中，肿瘤内tls与预后改善相关，而癌周tls 提示预后较差。在 crc 中，位于肿瘤侵袭前沿的 tls 提示更好的生存。然而，一些辅助 t 细胞主导的 tls 与 ii 期或iii 期 crc 患者的疾病复发相关。目前，对于转移性 crc 细胞在肝脏中遇到的独特微环境以及tls 的分布和临床意义仍了解不足。作为 tls 的主要成分，b细胞和浆细胞 (pc)产生抗体对体液免疫至关重要，抗体可以通过抗体依赖性细胞毒性 (adcc) 和吞噬作用（adcp）、补体依赖性细胞毒性以及增强抗原呈递发挥作用。然而，对于 crlm中 b 细胞的形成和生物学功能知之甚少，本发明的研究中，我们利用单细胞多组学测序、患者来源的tls相关单克隆抗体和人源化小鼠模型，研究了crlm中与tls 相关的抗体的差异，合成并筛选了具有抗肿瘤功能的抗体，为结直肠癌肝转移 (crlm)治疗提供了新的途径。
技术实现思路
1、本发明使用肿瘤浸润 tls 相关 pc来源的配对bcr 重链 (igh) 和轻链 (igl)体外生成了多种单克隆抗体，筛选高突变频率、高克隆扩增的序列制备了人-鼠嵌合单克隆抗体和全人源抗体，最终筛选出4种可以结合肿瘤并发挥抗肿瘤功能的抗体，证明了 crlm 患者肿瘤组织中原位生成抗体的肿瘤反应性。
2、抗体结合片段
3、一方面，本发明提供一种抗体结合片段，所述结合片段为重链可变区和/或轻链可变区片段，所述重链可变区氨基酸序列如seq id no:1、5、9或13所示；所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no:3、7、11或15所示；
4、在一个实施方式中，所述抗体结合片段的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:3所示；
5、在一个实施方式中，所述抗体结合片段的重链可变区氨基酸序列如seq id no:5所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:7所示；
6、在一个实施方式中，所述抗体结合片段的重链可变区氨基酸序列如seq id no:9所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:11所示；
7、在一个实施方式中，所述抗体结合片段的mab6的重链可变区氨基酸序列如seq idno:13所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:15所示。
8、术语“抗体结合片段”通常指全长抗体的一个或多个片段，其保持与所述抗体结合的能力。在一些实施方式中，所述抗体结合片段与本发明提供的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换、缺失或添加。本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。
9、在一些实施方案中，抗体结合片段包含的氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如peg、药物、毒素或标签)。
10、在一些实施方案中，抗体结合片段包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体结合片段的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体结合片段与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体结合片段可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
11、在一些实施方案中，抗体结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或peg缀合。抗体结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
12、在一些实施方式中，所述抗体结合片段中所结合的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体；可选的，所述人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体或全人源化抗体。
13、术语“单克隆抗体（monoclonal antibody，简称mab）” 是由单一b细胞克隆产生的具有相同特异性的抗体。通过基因工程技术，可以对单克隆抗体进行改造，以提高其稳定性、亲和力或效应功能。单克隆抗体可以被改造成人源化抗体，这些抗体在人体内的耐受性更好。
14、术语“多克隆抗体（polyclonal antibodies，简称pabs）”是指由多种b细胞克隆产生的抗体混合物，这些b细胞对同一抗原的不同表位产生反应。
15、术语“双特异性抗体（bispecific antibodies，简称bsab）”通常指能够同时与两种不同类型的抗原结合的人工蛋白质，含有两个不同的抗原结合域，在自然状态下是不存在的，只能通过人工制备，双特异的制备从最初将两个不同的、纯化的单克隆抗体通过现有技术如化学偶联、基因工程法等方法制备获得。
16、术语 “人源化”是指：抗体主要通过氨基酸残基与靶抗原相互作用，所述氨基酸残基位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)中。为此，各个抗体之间的cdr内部的氨基酸序列比cdr外部的序列更加多样。因为cdr序列负责大部分抗体-抗原相互作用，通过构建表达载体来表达模拟特异性天然存在的抗体的性质的重组抗体是可能的，所述表达载体包括接枝到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列的特异性天然存在的抗体的cdr序列。这样的框架序列可从包括种系抗体基因序列的公共dna数据库获得。这些种系序列将不同于成熟的抗体基因序列，因为它们不包括完全组装的可变基因，其在b细胞成熟期间通过v(d)j连接形成。
17、在一些实施方式中，基于抗体的恒定区部分（即ch和cl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码，不同的制备过程下所述人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体或全人源化抗体等几类 。
18、术语“嵌合抗体（chimeric antibodies）”是利用dna重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有另一物种抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体。
19、术语“改型抗体”也称cdr植入抗体(cdr grafting antibody)，抗体可变区的cdr是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的cdr移植至人源抗体可变区，替代人源抗体cdr，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
20、术语“表面重塑抗体（surface reshaping antibodies）”是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体sar（structure-activityrelationship）差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。
21、术语“全人源化抗体（fully human antibodies）”是将人体抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
22、在一些实施方案中，本发明提供一种人源化抗体，包括恒定区（c区）和可变区（v区），所述可变区包括重链可变区（vh）和轻链可变区（vl），
23、在一种实施方式中，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:3所示；
24、在一种实施方式中，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:5所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:7所示；
25、在一种实施方式中，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:9所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:11所示；
26、在一种实施方式中，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:13所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:15所示。
27、在一个实施方式中，所述恒定区包括人或鼠源的恒定区。
28、多核苷酸
29、另一方面，本发明提供一种编码所述抗体结合片段的多核苷酸。
30、在一个些实施方式中，所述重链可变区多核苷酸序列如seq id no:2、6、10或14所示；所述轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:4、8、12或16所示。
31、在一个实施方式中，编码所述结合片段的多核苷酸重链可变区多核苷酸序列如seq id no:2，轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:4所示；
32、在一个实施方式中，编码所述结合片段的多核苷酸重链可变区多核苷酸序列如seq id no:6，轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:8所示；
33、在一个实施方式中，编码所述结合片段的多核苷酸重链可变区多核苷酸序列如seq id no:10，轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:12所示；
34、在一个实施方式中，编码所述结合片段的多核苷酸重链可变区多核苷酸序列如seq id no:14，轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:16所示；
35、所述的多核苷酸序列与seq id no .2、4、6、8、10、12、14或16所示序列具有至少90％的序列同一性，例如，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的同一性。在一些实施例中，所述多核苷酸序列与seq id no .2、4、6、8、10、12、14或16所示序列相比具有一个或多个碱基的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个碱基的置换、缺失或添加)的序列。
36、本领域技术人员清楚，基于遗传密码中存在简并性，大多数氨基酸都由多个不同的密码子编码，遗传密码是生物体内将dna或mrna上的遗传信息翻译成蛋白质的过程，其中每个氨基酸由一个或多个特定的三核酸序列（密码子）编码，基于该特性，不同的核酸序列（密码子）可以转录翻译成同一种氨基酸，只要多核苷酸序列的改变不导致翻译为不同氨基酸或使蛋白质生物活性的失活，则该多核苷酸序列落在本发明的范围内。
37、组合物
38、另一方面，本发明提供一种组合物，其包含所述的抗体结合片段，或所述的抗体，或所述的多核苷酸，和药学上可接受的载体；
39、在一些实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体，它们是本领域技术人员知晓的可以是天然存在或人工合成的载体结构；在一些具体的实施方式中，所述载体选自质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞，如所述载体选自噬菌体展示载体：利用噬菌体作为载体，将抗体可变区基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使抗体片段展示在噬菌体表面；酵母展示载体：通过酵母表面展示技术，将抗体可变区基因与酵母细胞壁蛋白融合，展示在酵母细胞表面；核糖体展示载体：利用核糖体展示技术，将抗体可变区基因与核糖体rna结合，形成mrna-蛋白质-核糖体复合体等。
40、在一个实施方案中，本发明提供一种表达载体，该表达载体含所述的多核苷酸；在一些实施方案中，其还包括与之可操作连接的调控元件，所述的调控元件如：增强子、启动子、终止子、标记基因或报告基因。
41、在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，含所述的表达载体，该表达载体：用于将抗体可变区基因克隆到适合在宿主细胞中表达的载体上，如质粒（plasmid）或病毒载体，以产生重组抗体或其片段。
42、免疫偶联物
43、本发明提供一种免疫偶联物，包含所述的抗体结合片段，或所述的抗体，或所述的多核苷酸，所述抗体结合片段、抗体或多核苷酸连接至治疗剂，在一些实施方式中，所述治疗剂是药物、细胞毒素或放射性同位素，在一个具体的实施方式中，所述免疫偶联物为抗体-药物偶联物（adcs），由单克隆抗体、药物（细胞毒性有效载荷）和连接子组成。
44、术语“免疫偶联物（immunoconjugates）”是一类将生物活性分子与抗体连接起来的复合物。这种偶联可以增强药物的靶向性，使其能够更精确地作用于特定的细胞或组织。
45、嵌合抗原受体(car)
46、本发明提供一种嵌合抗原受体(car)，其抗原识别区含所述的结合片段，或所述的多核苷酸。在一些实施方式中，本发明提供一种免疫活性细胞，其表达所述的car；优选的，所述免疫活性细胞为car-t或car-nk细胞。
47、术语“嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，简称car）”是一种合成的受体，在一些实施方式中，通常用于工程化t细胞疗法（也称为car-t疗法），以及car-nk细胞疗法，所述car结构包括抗原识别区：通常来源于单克隆抗体的可变区，形成scfv（单链抗体片段），能够特异性识别癌细胞表面的抗原；跨膜区：连接car的抗原识别区和细胞内信号区，通常来源于免疫细胞的天然受体；共刺激信号区：提供必要的第二信号，增强t细胞的激活和增殖，常见的共刺激分子包括cd28、4-1bb（cd137）、ox40（cd134）等；激活区：通常来源于t细胞受体（tcr）的ζ链，负责传递激活信号；细胞内信号区：参与t细胞的激活、增殖和细胞因子的产生。
48、在一些实施方式中，本发明提供一种药物组合物，含所述的抗体，或所述的免疫偶联物，或所述的免疫活性细胞，本发明提供的抗体、免疫偶联物或免疫活性细胞可以和其他药物一起联合施用，如化疗药物（氟尿嘧啶、奥沙利铂、雷替曲塞、亚叶酸或伊立替康等）、靶向治疗药物（西妥昔单抗、贝伐珠单抗等）或免疫治疗药物（如pd-1/pd-l1抑制剂等）。
49、在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述的抗体结合片段，或所述的抗体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的宿主细胞，或所述的组合物，或所述的免疫偶联物，或所述的嵌合抗原受体，或所述的免疫活性细胞，或所述的药物组合物。
50、 应用
51、在一些实施方案中，本发明所述的抗体结合片段，或所述的抗体，或所述的多核苷酸，或所述的表达载体，或所述的宿主细胞，或所述的组合物，或所述的免疫偶联物，或所述的嵌合抗原受体所述的免疫活性细胞，或所述的药物组合物，或所述的试剂盒在制备治疗疾病药物中的应用，优选的，所述疾病为结直肠癌或结直肠癌肝转移肿瘤。
52、本发明达到的技术效果：
53、本发明研究中使用单细胞 rna 测序和 空间增强分辨率组学测序 (stereo-seq)，发现 tls+肿瘤富含 igg+ 浆细胞 (pc)，而 tls- 肿瘤富含 iga+ pc 。通过在体外合成 tls相关pc来源的单克隆抗体，发现 tls相关pc 可以分泌肿瘤靶向抗体。进一步的，我们筛选高突变频率、高克隆扩增的20个序列进行抗体合成，最终筛选出4种可以结合肿瘤并发挥抗肿瘤功能的抗体mab6、mab7、mab9、 mab10，我们在体外实验中证明了抗体mab6、mab7、mab9、mab10介导巨噬细胞吞噬肿瘤的功能，并在患有人类结直肠癌的人源化小鼠中证明了抗体mab6的抗肿瘤活性。
54、本发明证明肿瘤浸润的pc原位产生的靶向肿瘤的igg抗体在体外促进肿瘤杀伤，并在体内抑制患有人类结直肠癌的人源化小鼠的肿瘤生长。本发明对肿瘤 tls 来源单克隆抗体的进一步探索为开发针对癌症新型免疫治疗策略提供了参考。
1.一种抗体结合片段，其特征在于，所述结合片段为重链可变区和/或轻链可变区片段，所述重链可变区氨基酸序列如seq id no:1、5、9或13所示；所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no:3、7、11或15所示。
2.根据权利要求1所述的抗体结合片段，其特征在于，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体或人源化抗体；可选的，所述人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体或全人源化抗体。
3.一种抗体，包括恒定区和可变区，所述可变区包括重链可变区和轻链可变区，其特征在，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区氨基酸序列如seqid no:3所示；
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述恒定区包括人或鼠源的恒定区。
5.一种编码权利要求1或2所述抗体结合片段的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述重链可变区多核苷酸序列如seqid no:2、6、10或14所示；所述轻链可变区多核苷酸序列如seq id no:4、8、12或16所示。
7.一种表达载体，其特征在于，含权利要求5或6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，含权利要求7所述的表达载体。
9.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的抗体结合片段，权利要求3或4所述的抗体，或权利要求5或6所述的多核苷酸，和药学上可接受的载体。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的抗体结合片段，或权利要求3或4所述的抗体，或权利要求5或6所述的多核苷酸，所述抗体结合片段、抗体或多核苷酸连接至治疗剂。
11.根据权利要求10所述的免疫偶联物，其特征在于，治疗剂包括药物、细胞毒素或放射性同位素。
12.一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，其抗原识别区含权利要求1所述的结合片段，或权利要求5或6所述的多核苷酸。
13.一种免疫活性细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求12所述的car；优选的，所述免疫活性细胞为car-t或car-nk细胞。
14.一种药物组合物，其特征在于，含权利要求3或4所述的抗体，或权利要求10或11所述的免疫偶联物，或权利要求13所述的免疫活性细胞。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的抗体结合片段，或权利要求3或4所述的抗体，或权利要求5或6所述的多核苷酸，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的宿主细胞，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10或11所述的免疫偶联物，或权利要求12所述的嵌合抗原受体，或权利要求13所述的免疫活性细胞，或权利要求14所述的药物组合物。
16.权利要求1或2所述的抗体结合片段，或权利要求3或4所述的抗体，或权利要求5或6所述的多核苷酸，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的宿主细胞，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10或11所述的免疫偶联物，或权利要求12所述的嵌合抗原受体，或权利要求13所述的免疫活性细胞，或权利要求14所述的药物组合物，或权利要求15所述的试剂盒在制备治疗疾病药物中的应用，优选的，所述疾病为结直肠癌或结直肠癌肝转移肿瘤。
