本发明涉及核酸检测，更具体地涉及一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用。
背景技术：
1、核酸检测技术是近年来应用最为广泛的一种分子诊断技术,在感染性疾病诊断中此类技术可快速高效扩增病原菌的特征性核苷酸序列,已在临床诊断、疾病筛查等领域中得到广泛应用。传统的核酸检测步骤通常包括：样本灭活、核酸提取与纯化、核酸扩增和检测等步骤。其中核酸提取与纯化则是分子生物学实验中的关键，其关系着能否提取出高质量的核酸，能够直接影响到后续试验的成败。对于核酸提取纯化，目前试剂盒提供的试剂常常步骤繁琐需要耗费较长时间且易由于操作方式或实验环境引发交叉污染，所以对医疗人员的实验能力和检测环境有较高要求。
2、核酸提取是病原体研究的基本步骤，而细菌裂解是第一步。细菌表面有很厚的多糖荚膜，核酸提取困难。细菌裂解可分为机械、物理、化学或生物方法。机械方法是使细胞膜通过机械剪切力被物理分解，常见的机械设备包括高压均质器和珠磨机。物理方法是一种利用外力破坏细胞膜的非接触方法，这些力包括热能、高压、电能和声能。化学方法是通过改变裂解缓冲液ph来破坏细胞膜或在裂解缓冲液中加入表面活性剂，使膜蛋白溶解，并使膜破裂释放其内容物。生物方法是通过酶解作用破坏细菌/细胞结构，常用的酶解酶包括溶菌酶、纤维素酶等。然而传统的裂解方法存在装置复杂、化学试剂污染、成本高、样品用量大等局限性。微流控芯片因其小型化、低消耗、集成化等优点而被广泛应用于微生物分析。目前的裂解方法有：机械裂解、热裂解、化学裂解、光学裂解、声学裂解和电裂解。这些方法中，电裂解是通过在细胞膜上施加一个强电场，从而产生跨膜电位，当电位高于阈值电位时，细胞膜上会形成孔，细胞外物质可渗透过细胞膜，然后通过渗透冲击破坏细菌结构。电裂解是一种快速、无试剂的裂解方法，广泛应用于微流体领域。目前，常见的电裂解方法是利用高频低压交流电(ac)或高压直流电(dc)对细菌施加强电场，产生跨膜电位。电裂解方法结合微流控芯片成功地用于细胞/细菌裂解用途。
3、核酸扩增和检测则是将提取纯化的病原菌特征性核苷酸序列进行高效快速扩增并进行荧光或可视化检测，以获得即时诊断结果。核酸扩增方法的时长、灵敏度及特异性也将直接影响后续结果的判读。目前核酸扩增检测常用的方法为实时荧光定量pcr，其可以对样品中的核酸进行定性和定量分析，为目前核酸扩增检测的金标准。但其缺点在于该方法的定量分析必须依赖标准曲线的存在，无法实现核酸分子的绝对定量，并且在核酸含量低时无法检测低丰度的靶基因，造成假阴性的结果。
4、因此，核酸提取、扩增、检测一体化的操作装置在分子诊断领域的应用还存在尚需解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，从而解决现有核酸检测技术存在的一体化集成检测难、操作方式繁琐等问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
3、根据本发明的第一方面，提供一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片，由pdms层和玻璃基底组装而成，包括：细菌裂解模块，其包括：进样孔、通过微流道与所述进样孔连接的裂解腔，安装于所述玻璃基底上的电极，使用电镀工艺在所述玻璃基底上形成的间隔布置的四个金属镀层，所述四个金属镀层中的两个与正电极相连，另外两个与负电极相连；核酸纯化检测模块，其包括：与所述裂解腔依次连接的第一洗涤腔、第二洗涤腔、扩增腔，各腔体之间通过微流道连通，通过在微流道内填充油相可使各反应试剂互不串扰；其中，所述金属镀层在所述裂解腔中呈现裸露状态，通过与电极连接，所述金属镀层产生强电场，产生跨膜电位实现细菌的高效裂解。
4、优选地，所述四个金属镀层中，第一个金属镀层和第三个金属镀层与负电极相连，第二个金属镀层和第四个金属镀层与正电极相连。
5、优选地，所述裂解腔分为中间大腔室和两端小腔室，所述中间大腔室和两端小腔室之间通过缩窄段相连，所述缩窄段与相邻金属镀层的间隙相对应。
6、优选地，相邻金属镀层分别以0.7mm～0.9mm的间距间隔布置。
7、优选地，所述金属镀层为长条形形状。
8、优选地，所述金属镀层为铜合金。
9、优选地，所述多重pcr微流控芯片包括在所述玻璃基底上的两侧对称布置：两个细菌裂解模块和两个核酸纯化检测模块。
10、根据本发明的第二方面，提供一种如上面所述的集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片在检测病原体中的应用。
11、根据本发明的一个优选方案，所述应用包括以下步骤：s1，准备阶段：将裂解液、洗涤液、核酸扩增液分别从裂解腔，洗涤腔，扩增腔依次注入，并通过油相隔开，再通过加样孔，将含有病原体的样本注入裂解腔；s2，核酸的提取纯化：裂解腔下电镀金属层通过正负极连接在电源上，通过fy6900双通道信号电压发生器调节电压实现细菌的裂解，同时在裂解液的作用下细菌被裂解，释放的核酸分子被磁珠吸附，手持磁体拖动磁珠依次进入第一洗涤腔、第二洗涤腔，完成洗涤后的核酸分子继续由磁铁操纵进入扩增腔；s3，pcr扩增检测：在加热模块的作用下，核酸分子在扩增腔室中完成pcr反应，通过cmos荧光相机仪器对荧光基团发出的不同波长进行检测，即可实现对病原体的精准相对定量检测。
12、正如背景技术部分所述，目前核酸扩增检测常用的方法为实时荧光定量pcr，其缺点在于该方法的定量分析必须依赖标准曲线的存在，无法实现核酸分子的绝对定量，并且在核酸含量低时无法检测低丰度的靶基因，造成假阴性的结果。
13、针对上述现象，发明人在已有研究的基础上及查阅文献，总结过去实验中的不足，将细菌核酸裂解技术与磁控技术在微流控芯片中集成。具体地，本发明在原有芯片基础之上，进一步在玻璃基底上加入了电极，并使用电镀工艺在玻璃基底上形成间隔布置的四个金属镀层，通过与电极连接产生强电场，产生跨膜电位实现细菌的裂解，移动磁珠与核酸结合。简化了裂解过程的加热，简化了预混步骤，实现了集核酸裂解提取纯化与磁控技术一体化的高灵敏、简易操作装置，可以实现多重pcr反应，同时检测多种病原体。而现有文献报道对于电裂解细菌方法仅限于电裂解阶段，没有将核酸提取纯化扩增汇集一体，本发明创造性地通过将电裂解细菌技术与磁珠提取技术相结合，显著提高了核酸的提取效率。
14、根据本发明提供的一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，相对于现有技术具有以下有益效果：
15、1)该多重pcr微流控芯片将细菌核酸裂解提取纯化及多重pcr检测集成在一起，能够在同一个芯片上实现对细菌的核酸提取纯化和pcr检测以及精准定量检测；
16、2)本发明在原有芯片基础上进一步在玻璃基底上安装电极，并使用电镀金属层工艺在玻璃基底上镀一层铜合金金属层，通过键合和胶黏工艺将pdms层与玻璃基底进行封装键合，金属镀层在微流控芯片的裂解腔呈现裸露状态，通过与电源连接，金属镀层产生强电场，产生跨膜电位实现细菌的裂解，移动磁珠与核酸结合；磁珠再依次进入洗涤腔室和扩增腔，实现微流控芯片上核酸提取纯化扩增一体化流程。
17、3)根据本发明提供的多重pcr微流控芯片在分子诊断领域具有潜在的应用性。
18、总之，本发明提供了一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片及其应用，在同一个芯片上实现了对细菌的核酸提取纯化和pcr检测，具有精准度高、操作简便的优点，在分子诊断方面具有广阔的应用前景。
1.一种集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片，由pdms层和玻璃基底组装而成，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述四个金属镀层中，第一个金属镀层和第三个金属镀层与负电极相连，第二个金属镀层和第四个金属镀层与正电极相连。
3.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述裂解腔分为中间大腔室和两端小腔室，所述中间大腔室和两端小腔室之间通过缩窄段相连，所述缩窄段与相邻金属镀层的间隙相对应。
4.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，相邻金属镀层分别以0.7mm～0.9mm的间距间隔布置。
5.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述金属镀层为长条形形状。
6.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述金属镀层为铜合金。
7.根据权利要求1所述的多重pcr微流控芯片，其特征在于，所述多重pcr微流控芯片包括在所述玻璃基底上的两侧对称布置：两个细菌裂解模块和两个核酸纯化检测模块。
8.一种根据权利要求1～7中任意一项所述的集电裂解细菌与核酸纯化检测为一体的多重pcr微流控芯片在检测病原体中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
