本发明属于医药，具体涉及基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统及其制备方法和应用。
背景技术：
1、随着人们对健康的关注度不断提高，肠道健康问题日益受到重视。炎症性肠病(ibd)作为一种临床常见的肠道疾病，因其发病机制复杂，传统的治疗手段仅能起到有限的效果。因此，寻求新的治疗手段和策略对于改善患者生活质量具有重要意义。近年来，益生菌疗法在调节肠道微生物、生理环境和免疫系统稳态平衡方面具有显著的优势而被广泛应用于包括炎症性肠病等多种疾病的临床治疗。
2、炎症性肠病由于其肠道炎症稳态失衡，导致病灶处产生大量的活性氧，降低益生菌的活性和肠道定植能力。研究表明，抑制炎症有助于肠道黏液层修复，改善肠道微生物结构，存进益生菌定植，进而促进炎症性肠病的治疗。二氧化锰纳米粒能够催化过氧化氢分解，清除ros，降低氧化应激水平，抑制肠道炎症反应。枯草芽孢杆菌通过降低结肠组织中促炎细胞因子的表达，改善结肠炎症水平，具有一定的抗炎特性。菌体表面修饰是一种简单但有效地赋予菌体外源特性的策略，利用枯草芽孢杆菌表面容易修饰的特征，在其表面沉积二氧化锰纳米粒，一方面，二氧化锰赋予细菌抗炎、抗氧化的生理特性；另一方面，二者多通路协同发挥抗炎作用。此外，二价的锰离子可以掺入细菌表面蛋白中，促进细菌的生长增殖。然而，益生菌在通过胃肠道的过程中可能会受到胃酸和其他消化酶的破坏，导致活性降低或丧失，限制其应用。研究表明，脂质体具有良好的的生物相容性，保护细菌抵抗胃酸环境顺利过胃，并提高其在肠道内的稳定性与生物活性。
3、因此，目前尚没有能将益生菌、纳米技术和脂质体等多种技术相结合，以实现更高效、更安全的结肠炎治疗的报道。
技术实现思路
1、发明目的：本发明可有效解决益生菌在通过胃肠道的过程中受到胃酸和其他消化酶的破坏，导致活性降低或丧失这一难题，提高其在体内的稳定性和生物活性，本发明所要解决的技术问题是提供了将益生菌、纳米技术和脂质体等多种技术相结合的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统。
2、本发明还要解决的技术问题是提供了基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法。
3、本发明最后要解决的技术问题是提供了该基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的应用。
4、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统，所述递送系统包括脂质体外衣、益生菌和修饰益生菌的纳米酶，所述脂质体外衣、益生菌和修饰益生菌的纳米酶的体积比为1:1-5:1，所述益生菌的含量为1×107cfu/ml-1×109cfu/ml，所述脂质体外衣包括dspe-tk-peg、l-α-磷脂酰胆碱与胆固醇制备而成。
5、其中，所述dspe-tk-peg与胆固醇的质量比为1:1-3:1，所述l-α-磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为2:1-10:1。
6、进一步，所述dspe-tk-peg与胆固醇的质量比为1:1。
7、进一步，所述l-α-磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比优选为4:1。
8、其中，所述益生菌包括枯草芽孢杆菌，所述纳米酶包括二氧化锰纳米酶。
9、本
技术实现要素：
还包括所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，包括以下步骤：
10、1)制备脂质体外衣：将dspe-tk-peg、l-α-磷脂酰胆碱、胆固醇溶于氯仿中，得到反应液1；所得的反应液1旋转蒸发除去氯仿，加入超纯水，得到反应液2；冷冻干燥得到所述脂质体外衣；
11、2)纳米酶修饰益生菌：将纳米酶与益生菌混合制得；
12、3)脂质体外衣包被益生菌纳米酶：将脂质体外衣与益生菌纳米酶混合制得。
13、其中，步骤1)中所述反应液1的制备条件为：25℃，100w超声5min溶解。
14、其中，步骤1)中所述反应液2的制备条件为：40℃，20rpm旋蒸10min。
15、进一步，步骤1)中所述dspe-tk-peg、l-α-磷脂酰胆碱、胆固醇、氯仿的质量比为1:4:1:0.5。
16、其中，步骤2)中所述益生菌的培养：将益生菌冻干粉接种于lb液体培养基中，在37℃恒温摇床培养48h，收集细菌悬液，置于4℃保存备用；
17、其中，所述的lb液体培养基的组成是：10g蛋白胨、5g酵母粉及10g氯化钠溶于1000ml的蒸馏水中，调节ph至7.0。
18、其中，步骤2)中所述纳米酶为羧基二氧化锰纳米酶，所述益生菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌含量为1×107cfu/ml-1×109cfu/ml。
19、其中，步骤2)中益生菌纳米酶为羧基二氧化锰纳米酶，其合成步骤具体为：将1gkmno4加入125ml超纯水中搅拌30min，然后，加入2.5ml油酸在室温下搅拌24小时，之后在8000rpm下离心5min，沉淀用无水乙醇洗涤三次获得mno2纳米粒。将100mg干燥的mno2纳米粒分散在10ml甲苯中。将200mg 2,3-二巯基丁二酸(dmsa)和200mg nahco3分散在100ml丙酮中。两溶液相混合，混合物在80℃下反应6h。最后，将获得的羧基二氧化锰(mno2-cooh)离心并用丙酮洗涤三次，分散在超纯水中备用；
20、其中，步骤2)中二氧化锰纳米酶修饰枯草芽孢杆菌的具体制备步骤为：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液(edc 20mg/ml，nhs10mg/ml)加入到5ml所述s2溶液中活化30min。然后，加入2ml所述s1溶液(1×108cfu/ml，ph＝7.4)，反应1h，5000rpm离心除去过量的mno2-cooh，得到纯化的bs@mno2；
21、其中，步骤3)中脂质体外衣与益生菌纳米酶的体积比为1:1-5:1，反应条件为：先在37℃条件下孵育20-60min，随后100w功率超声处理1-10min，接着37℃继续孵育20-60min，最后3000-8000rpm离心3-10min。
22、步骤3)中的具体制备步骤如下：
23、s1：将上述制备的1ml脂质体外衣(lip)与1ml bs@mno2溶液混合均匀，得到反应液s1；
24、s2：反应液s1先在37℃条件下孵育20min，随后100w功率超声处理1min，最后37℃继续孵育30min，得到反应液s2；
25、s3：将反应液s2，5000rpm离心10min，纯化进一步得到lip/bs@mno2。
26、本发明内容还包括所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统在制备结肠炎的药物中的应用。
27、本发明内容还包括所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统在缓解氧化应激微环境中的应用。
28、本发明的机理：脂质体外衣赋予益生菌递送系统良好的胃酸抗性，保护系统顺利过胃并定植于结肠组织。其中，lip响应结肠氧化应激的生理环境，敏感释放bs@mno2，其中，mno2有一定的抗炎和抗氧化作用，可有效减轻肠道炎症反应，降低活性氧(ros)水平，而枯草芽孢杆菌在肠道定植后，利用结肠中的活性物质进行生理性代谢产生抗菌物质，有效抑制了有害细菌的生长，进而起到调节肠道菌群的作用。
29、有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明通过二氧化锰纳米酶与枯草芽孢杆菌的协同作用对结肠炎以及其他炎性肠病的治疗提供了一种安全、高效的综合性治疗策略。本发明可有效解决益生菌在通过胃肠道的过程中受到胃酸和其他消化酶的破坏，导致活性降低或丧失这一难题，提高其在体内的稳定性和生物活性。
1.基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统，其特征在于，所述递送系统包括脂质体外衣、益生菌和修饰益生菌的纳米酶，所述脂质体外衣和修饰益生菌的纳米酶的体积比为1:1-5:1，所述益生菌的含量为1×107cfu/ml-1×109cfu/ml，所述脂质体外衣包括dspe-tk-peg、l-α-磷脂酰胆碱与胆固醇制备而成。
2.根据权利要求1所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统，其特征在于，所述dspe-tk-peg与胆固醇的质量比为1:1-3:1，所述l-α-磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为2:1-10:1。
3.根据权利要求1所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统，其特征在于，所述益生菌包括枯草芽孢杆菌，所述纳米酶包括二氧化锰纳米酶。
4.权利要求1～3任一项所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述反应液1的制备条件为：25℃，100w超声5min溶解。
6.根据权利要求4所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述反应液2的制备条件为：40℃，20rpm旋蒸10min。
7.根据权利要求4所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述纳米酶为羧基二氧化锰纳米酶，所述益生菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌含量为1×107cfu/ml-1×109cfu/ml。
8.根据权利要求4所述的基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，步骤3)中脂质体外衣与益生菌纳米酶的体积比为1:1-5:1，反应条件为：先在37℃条件下孵育20-60min，随后100w功率超声处理1-10min，接着37℃继续孵育20-60min，最后3000-8000rpm离心3-10min。
9.权利要求1～3任一项所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统在制备结肠炎的药物中的应用。
10.权利要求1～3任一项所述基于外衣包被益生菌纳米酶递送系统在缓解氧化应激微环境中的应用。
