本发明属于中医药，具体涉及一种桑叶品种鉴定的双分子标记方法。
背景技术：
1、
2、我国桑种质资源已达上千种，且有逐年增多趋势。桑树在长期进化选择和被选择过程中，逐步演化出农艺性状、生理代谢、化学成分等方面的遗传多样性，进而表达为药理毒理、品质内涵的异同。国内外学者通过issr(inter-simple sequence repeat)、alfp(amplified frag-ment length polymorphism)、ssr(simple sequence repeat)等分子标记技术解析桑种质资源间的遗传多样性，揭示了桑种质资源间的亲缘关系与地理分布、生态型、起源、产量形状具有显著相关性，但目前尚未见桑叶遗传多样性与药理作用、化学成分之间相互关系的研究报道。
3、故本研究采集了69份山东主栽品种，首次建立了可以表征疏散风热功效偏向性的双分子鉴别体系。通过对其解热作用进行分析，构建了ssr和uplc-ms指纹图谱，分别从药效、分子、化学水平揭示了品种之间解热作用、遗传结构、化学成分的多样性和相关性，筛选了一套包含7个ssr位点的核心标记组合，指认了桑叶具有药效偏向性的“化学-分子”双分子标记物，为桑叶疏散风热功效偏向性品种的选育提供重要遗传资源，同时，也为桑叶品种鉴定、药用价值深度应用提供了技术支持。
技术实现思路
1、本发明以山东省桑主栽品种为研究对象，构建69份不同品种桑叶的ssr/uplc-ms双指纹图谱和解热作用聚类图，比较解热作用、遗传结构、化学成分差异性，分析“药效-分子-成分”相关性。通过研究，确定ssr/uplc-ms双指纹图谱最终筛选分子标记物为一套包含7个ssr位点的核心标记组合，化学标记物为隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷，确定了具有疏散风热功效药效偏向性的“化学-分子”双分子标记物。
2、首先，从分子层面，筛选到的一套包含7个ssr位点的核心标记组合，可作为桑叶品种鉴别的分子标记物；再者，从化学成分层面，筛选到的隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷，可作为桑叶品种鉴别的化学标记物，相比之前的单层面鉴别方法，本发明建立的双分子标记物可从分子和化学两个层面鉴别桑叶品种。另外，本发明还有一个特点，本发明确定的双分子标记物是与功效相关的，是具有疏散风热功效药效偏向性的“化学-分子”双分子标记物，之前报道的标记物要么是单一层面，要么不能体现功效。本发明为创建桑叶品种“药效-分子-成分”的高通量鉴定模式提供参考依据，为推进我国桑叶药用价值精细化、资源高值化利用提供重要支撑。
3、因此本发明提供一种桑树tp-m13-ssr分子标记核心引物组,其特征在于,包括7对ssr分子标记核心引物对和通用m13引物:
4、引物对1:tp1
5、f:5'-cgtggggcttaggctgagtagagg-3'
6、r:5'-caccaccactacttctcttcttccag-3'；
7、引物对2:tp2
8、f:5'-ggtcaagcgctccagagaaaag-3'
9、r:5'-ggtgcagaggatgaaagatgaggt-3'；
10、引物对3:tp3
11、f:5'-ccccctgcaatgccctctttc-3'
12、r:5'-tgggcgaggcagggaagattc-3'；
13、引物对4:tp5
14、f:5'-gccgtgtaccagtggagtttgca-3'
15、r:5'-tgaccgtttcttccactttacctaatg-3'；
16、引物对5:tp7
17、f:5'-tccttaggtttttggggtctgtttacat-3'
18、r:5'-cctcattctcctttcacttattgttg-3'；
19、引物对6:m2
20、f:5'-cttgggacaaaccattaccg-3'
21、r:5'-aggacatggggattggtgta-3'；
22、引物对7:m10
23、f:5'-ctcaggtacgctgtgctg-3'
24、r:5'-gactcaaagcacatgccaag-3'；
25、优选地，所有的上游引物的5’端加m13接头：tgtaaaacgacggccagt，m13接头的5’端添加荧光标记(例如fam荧光标记)。
26、具体地,所述的荧光报告基团为fam。
27、本发明还提供一种桑叶品种鉴别的化学标记物组合，其是由隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷的组合。
28、本发明还提供一种疏散风热功效药效偏向性的双分子标记物，其包括如权利要求1或2所述的ssr位点的核心标记组合和如权利要求3所述的化学标记物组合。
29、本发明也提供所述的ssr位点的核心标记组合、所述的化学标记物组合或如权利要求3所述的双分子标记物在桑叶品种鉴别中的应用。
30、具体地，用于鉴定具有疏散风热功效药效偏向性的桑叶品种。
31、本发明还提供一种桑叶品种鉴定的双分子标记方法，其包括如下步骤：
32、s1获取样品基因组dna，采用如权利要求1所述ssr位点的核心标记组合进行扩增；
33、s2获取样品的组织，用如权利要求2桑叶品种鉴别的化学标记物组合进行检测；
34、s3根据s1获得的检测结果，和s2得到检测结果，综合判断桑叶品种。
35、按所述ssr位点的核心标记组合进行扩增，以遗传相似系数0.43为阈值筛选样品，并且隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷为vip大于1的显著性差异成分的样品，即为具有疏散风热功效药效偏向性的桑叶品种。
36、通过研究，确定ssr/uplc-ms双指纹图谱最终筛选分子标记物为一套包含7个ssr位点的核心标记组合，化学标记物为隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷，确定了具有疏散风热功效药效偏向性的“化学-分子”双分子标记物。本发明为创建桑叶品种“药效-分子-成分”的高通量的鉴定模式，为推进我国桑叶药用价值精细化、资源高值化利用提供重要支撑。
1.一种桑树tp-m13-ssr分子标记核心引物组,其特征在于,包括7对ssr分子标记核心引物对和通用m13引物:
2.根据权利要求1所述的桑树ssr分子标记核心引物组,其特征在于,所述的荧光报告基团为fam。
3.一种桑叶品种鉴别的化学标记物组合，其特征在于，其是由隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、水杨酸、伞形花内酯、烟花苷、紫云英苷的组合。
4.一种疏散风热功效药效偏向性的双分子标记物，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的ssr位点的核心标记组合和如权利要求3所述的化学标记物组合。
5.如权利要求1或2所述的ssr位点的核心标记组合、如权利要求3所述的化学标记物组合或如权利要求4所述的双分子标记物在桑叶品种鉴别中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，用于鉴定具有疏散风热功效药效偏向性的桑叶品种。
7.一种桑叶品种鉴定的双分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
