1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基质胶及其制备方法和应用。
背景技术：2.类器官是一种三维细胞培养技术，可以在体外模拟体内器官的组织结构与基因表达。类器官为包含干细胞在内的多种细胞在体外经过自分化及自组装形成三位聚集体，其细胞种类、比例及细胞的空间结构及排列与体内器官具有较高的相似性，并可以模拟体内器官的部分功能。此外，与传统的二维细胞培养相比，类器官的基因表达与体内更为接近。因此，基于类器官的生物活性检测结果与体内更具有相关性。所以，目前类器官被广泛用于生物学研究、药物研究、医学研究、精准医学的转化应用等。
3.目前，由于细胞要求高，因此类器官的培养仍主要依赖于细胞外基质(ecm)凝胶等生物材料提供的支撑与空间。ecm凝胶虽具有较高的生物相容性，但其批间稳定性、成分的复杂与不可控性等问题限制了类器官的研究与应用。首先，目前主要的ecm凝胶均为生物制剂产品，由动物组织或细胞提取获得，但动物具有较大的个体差异，而细胞制剂也存在极大不稳定性和不确定性。此外，全合成水凝胶近来也被广泛尝试用于包括类器官在内的三维细胞培养，其优点在于合成材料的稳定性，以及结构的均一性。然而，全合成材料往往缺乏细胞生长所需的细胞因子，且生物相容性较差，因此，全合成水凝胶的细胞培养效率远逊于生物来源的基质胶。
技术实现要素：4.有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种基质胶及其制备方法和应用。
5.为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案为：
6.第一个方面，本发明提供一种基质胶的制备方法，包括以下步骤：
7.⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入胶原蛋白；
8.⑵
使用上述培养基重悬肉瘤细胞，然后接种至细胞培养装置中；
9.⑶
在转速为20-100rpm，温度为37℃的环境下进行培养；
10.⑷
培养过程中，每3-5天进行换液，换液时，1000rpm离心5-10分钟，移去上清，然后使用步骤
⑴
所述培养基重悬；
11.⑸
培养14-28天后，收集细胞；1000rpm离心5分钟，移去上清；
12.⑹
加入脱细胞液重悬沉淀，2-8℃处理过夜；
13.⑺
高速离心30min，收集上清至新的离心管；
14.⑻
加入步骤
⑹
所述脱细胞液重悬洗涤后，高速离心30min，收集上清至新的离心管，重复本步骤洗涤3次；
15.⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀；
16.⑽
合并后的液体使用透析液反复透析3-5次，每次透析2-4小时；
17.⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度，将液体浓缩至蛋白总浓度为10-15mg/ml即
可得到基质胶。
18.进一步的，所述胶原蛋白为i型胶原、ⅱ型胶原、ⅲ型胶原或ⅳ型胶原中的一种。
19.进一步的，所述胶原蛋白的加入量为培养基体积的1-10％。
20.进一步的，所述步骤
⑵
中按照10
5-106/ml的浓度重悬肉瘤细胞。
21.进一步的，所述肉瘤细胞为纤维肉瘤细胞或骨肉瘤细胞。
22.进一步的，所述脱细胞液是由1-4m尿素、0.2-2m硫酸铵、1-20mm edta和10-200mm乙酸组成。
23.进一步的，所述高速离心的条件是：4℃下12000rpm。
24.进一步的，所述透析液为1-20mm tris-hcl(ph＝7.0)。
25.第二个方面，本发明提供一种基质胶，是采用权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备而成。
26.第三个方面，本发明提供一种基质胶在类器官培养上的应用。
27.本发明的有益效果是：
28.本发明制备工艺简单，重复性好，适用于在实验室条件大规模操作，是一种稳定的细胞来源制备成基质水凝胶的方法。
29.相比于组织脱细胞基质胶，采用本发明方法制备的基质胶成分简单可控，杂质少，本发明采用的脱细胞液温和解离细胞且不破坏细胞外基质结构，采用的透析液为中性盐离子，适合保存蛋白成分，且适合应用于细胞培养，采用本发明方法保留了细胞外基质主要成分，有利于类器官培养。本发明制备方法可以使用人源细胞株进行基质胶制备，所得基质胶适合人源类器官生长，避免物种间来源差异，为未来用于体内实验打下基础。
附图说明
30.图1为实施例1获得的基质胶形态图；
31.图2为实施例2获得的基质胶37℃凝固后形态图；
32.图3为实施例3获得的基质胶形态图；
33.图4为实施例4获得的基质胶37℃凝固后形态图；
34.图5为应用实施例1得到的肺癌类器官在普通光学显微镜下的形态结构图；
35.图6为应用实施例2得到的类器官在普通光学显微镜下的形态结构图；
36.图7为应用实施例3得到的类器官在普通光学显微镜下的形态结构图。
具体实施方式
37.本发明实施例采用的tris-hcl(ph＝7.0)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
38.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
39.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
40.实施例1：
41.本发明的基质胶制备方法主要包括如下步骤：
42.⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入5％的i型胶原。
43.⑵
使用上述培养基按照106/ml的浓度重悬人纤维肉瘤细胞，然后接种至细胞培养瓶中。
44.⑶
将细胞培养瓶置于摇床中，设置转速为50rpm，然后将摇床整体置于细胞培养箱中37℃培养。
45.⑷
培养过程中，每4天进行换液。换液时，1000rpm离心7分钟，移去上清，然后使用步骤1培养基重悬。
46.⑸
培养20天后，收集细胞。1000rpm离心5分钟，移去上清。
47.⑹
在细胞沉淀中加入脱细胞液至沉淀全部混匀，重悬沉淀，5℃处理过夜。
48.⑺
4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。
49.⑻
加入步骤
⑹
脱细胞液重悬洗涤后，4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。重复本步骤洗涤3次。
50.⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀。
51.⑽
合并后的液体使用10mm tris-hcl(ph＝7.0)作为透析液反复透析4次。每次透析3小时。
52.⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.84mg/ml，将液体浓缩至蛋白总浓度为12mg/ml即可得到基质胶如图1所示。
53.本实施例所述脱细胞液是由2m尿素、1m硫酸铵、10mm edta和150mm乙酸按照常规方法配制而成，配制完121℃高温处理20分钟除菌。
54.实施例2：
55.本发明的基质胶制备方法主要包括如下步骤：
56.⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入1％的ⅱ型胶原。
57.⑵
使用上述培养基按照105/ml的浓度重悬人骨肉瘤细胞，然后接种至生物反应器中。
58.⑶
将生物反应器设置转速为100rpm，温度为37℃培养。
59.⑷
培养过程中，每3天进行换液。换液时，1000rpm离心5分钟，移去上清，然后使用步骤
⑴
培养基重悬。
60.⑸
培养28天后，收集细胞。1000rpm离心5分钟，移去上清。
61.⑹
在细胞沉淀中加入脱细胞液至沉淀全部混匀，重悬沉淀，8℃处理过夜。
62.⑺
4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。
63.⑻
加入步骤
⑹
脱细胞液重悬洗涤后，4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。重复本步骤洗涤3次。
64.⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀。
65.⑽
合并后的液体使用20mm tris-hcl(ph＝7.0)作为透析液反复透析3次。每次透析2小时。
66.⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度为1.14mg/ml，将液体浓缩至蛋白总浓度为15mg/ml即可得到基质胶。取基质胶滴在培养皿上，37℃凝固后如图2所示。
67.本实施例所述脱细胞液是由1m尿素、2m硫酸铵、20mm edta和200mm乙酸按照常规
方法配制而成，配制完高温除菌。
68.实施例3：
69.本发明的基质胶制备方法主要包括如下步骤：
70.⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入10％的ⅲ型胶原。
71.⑵
使用上述培养基按照106/ml的浓度重悬ehs细胞，然后接种至细胞培养瓶中。
72.⑶
将细胞培养瓶置于摇床中，设置转速为20rpm，然后将摇床整体置于细胞培养箱中37℃培养。
73.⑷
培养过程中，每5天进行换液。换液时，1000rpm离心10分钟，移去上清，然后使用步骤1培养基重悬。
74.⑸
培养28天后，收集细胞。1000rpm离心5分钟，移去上清。
75.⑹
在细胞沉淀中加入脱细胞液至沉淀全部混匀，重悬沉淀，2℃处理过夜。
76.⑺
4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。
77.⑻
加入步骤
⑹
脱细胞液重悬洗涤后，4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。重复本步骤洗涤3次。
78.⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀。
79.⑽
合并后的液体使用1mm tris-hcl(ph＝7.0)作为透析液反复透析5次。每次透析4小时。
80.⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.72mg/ml，将液体浓缩至蛋白总浓度为10mg/ml即可得到基质胶如图3所示。
81.本实施例所述脱细胞液是由4m尿素、0.2m硫酸铵、1mm edta和10mm乙酸按照常规方法配制而成，配制完121℃高温处理20分钟。
82.实施例4：
83.本发明的基质胶制备方法主要包括如下步骤：
84.⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入5％的ⅳ型胶原。
85.⑵
使用上述培养基按照106/ml的浓度重悬ehs细胞，然后接种至细胞培养瓶中。
86.⑶
将细胞培养瓶置于摇床中，设置转速为50rpm，然后将摇床整体置于细胞培养箱中37℃培养。
87.⑷
培养过程中，每4天进行换液。换液时，1000rpm离心7分钟，移去上清，然后使用步骤1培养基重悬。
88.⑸
培养20天后，收集细胞。1000rpm离心5分钟，移去上清。
89.⑹
在细胞沉淀中加入脱细胞液至沉淀全部混匀，重悬沉淀，5℃处理过夜。
90.⑺
4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。
91.⑻
加入步骤6脱细胞液重悬洗涤后，4℃条件下12000rpm高速离心30min，将杂质沉淀，收集上清至新的离心管。重复本步骤洗涤3次。
92.⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀。
93.⑽
合并后的液体使用10mm tris-hcl(ph＝7.0)作为透析液反复透析4次。每次透析3小时。
94.⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.84mg/ml，将液体浓缩至蛋白总浓度为12mg/ml即可得到基质胶。取基质胶滴在培养皿上，37℃凝固后如图4所示。
95.本实施例所述脱细胞液是由2m尿素、1m硫酸铵、10mm edta和150mm乙酸按照常规方法配制而成，配制完121℃高温处理20分钟。
96.对比例1：
97.本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
⑵
中按照106/ml的浓度重悬肺癌细胞h1975，其余同实施例1，结果透析后测定总蛋白浓度为0.24ng/ml，无法成胶。
98.对比例2：
99.本对比例与实施例1的区别仅仅在于脱细胞液的成分不同，本对比例中加入的脱细胞液的成分如下：1％sds，2m nacl，其余同实施例1，收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.19mg/ml。所得蛋白浓度远低于实施例1，这说明实施例1中脱细胞液有利于收获更多的基质胶蛋白。
100.对比例3：
101.本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
⑽
中使用生理盐水作为透析液，其余同实施例1。所得的基质胶浓缩后存放过夜，发现有沉淀析出，而实施例1没有。这说明tris-hcl(ph＝7.0)作为透析液有利于基质胶的保存。
102.对比例4：
103.本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
⑵
按照103/ml的浓度重悬纤维肉瘤细胞，其余同实施例1。在细胞培养过程中观察发现细胞数量少，最终收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.07mg/ml。所得蛋白浓度远低于实施例1，这说明实施例1中细胞浓度有利于收获更多的基质胶蛋白。
104.对比例5：
105.本对比例与实施例1的区别仅仅在于步骤
⑵
按照108/ml的浓度重悬纤维肉瘤细胞，其余同实施例1。在步骤4培养3天后发现细胞大量凋亡，最终收集透析后液体，测定蛋白总浓度为0.79ng/ml。所得蛋白浓度远低于实施例1，这说明实施例1中细胞浓度有利于收获更多的基质胶蛋白。
106.应用实施例1：
107.本发明的基质胶在肺癌类器官培养上的应用。
108.1)取适量肺癌类器官培养基与实施例1的基质胶等比混合，然后用混合液重悬肺癌细胞，再用移液器将混有细胞的胶滴到60mm培养皿中，每滴约50ul。
109.2)将接种胶滴后的培养皿放入co2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后小心倒扣，待其充分凝固30min。
110.3)在培养皿内加入肺癌类器官培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养。
111.4)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到肺癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图5所示，类器官平均尺寸大于100μm，细胞活性好。
112.应用实施例2：
113.本发明的基质胶在肠癌类器官培养上的应用。
114.1)将肠癌样本进行预处理，得到细胞数量为50个细胞的细胞团后，离心去除上清备用；
115.2)将动物肝脏类器官培养基与实施例2所述基质胶按1：1.2混合得到混合凝胶培
养液，置于冰上，然后用混合凝胶培养液重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，接种胶滴后于25℃静置2～3min，之后倒置胶滴继续保温静置，待其充分凝固；
116.3)将步骤2)获得的胶滴于室温下继续静置15min，进一步加入37℃预热的细胞培养基，并于37℃、5％co2浓度下培养，每隔2天更换一次细胞培养基，培养4天后得到类器官如图6所示，肠癌类器官大小平均直径超过50μm。
117.应用实施例3：
118.本发明的基质胶在小鼠肝脏类器官培养上的应用。
119.1)将鼠肝脏新鲜样本进行预处理，得到细胞数量为50个细胞的细胞团后，离心去除上清备用；
120.2)将动物肝脏类器官培养基与实施例3所述基质胶按1：2混合得到混合凝胶培养液，置于冰上，然后用混合凝胶培养液重悬步骤1)得到的细胞团沉淀，接种胶滴后于25℃静置2～3min，之后倒置胶滴继续保温静置，待其充分凝固；
121.3)将步骤2)获得的胶滴于室温下继续静置15min，进一步加入37℃预热的细胞培养基，并于37℃、5％co2浓度下培养，每隔2天更换一次细胞培养基，培养7天后得到类器官如图7所示，小鼠肝脏类器官呈空腔形的类器官。
122.综上所述，采用本发明方法保留了细胞外基质主要成分，有利于类器官培养。
123.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：1.一种基质胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴
配制培养基：在含10％胎牛血清的1640培养基中加入胶原蛋白；
⑵
使用上述培养基重悬肉瘤细胞，然后接种至细胞培养装置中；
⑶
在转速为20-100rpm，温度为37℃的环境下进行培养；
⑷
培养过程中，每3-5天进行换液，换液时，1000rpm离心5-10分钟，移去上清，然后使用步骤
⑴
所述培养基重悬；
⑸
培养14-28天后，收集细胞；1000rpm离心5分钟，移去上清；
⑹
加入脱细胞液重悬沉淀，2-8℃处理过夜；
⑺
高速离心30min，收集上清至新的离心管；
⑻
加入步骤
⑹
所述脱细胞液重悬洗涤后，高速离心30min，收集上清至新的离心管，重复本步骤洗涤3次；
⑼
将收集的上清液体合并，弃去沉淀；
⑽
合并后的液体使用透析液反复透析3-5次，每次透析2-4小时；
⑾
收集透析后液体，测定蛋白总浓度，将液体浓缩至蛋白总浓度为10-15mg/ml即可得到基质胶。2.根据权利要求1所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述胶原蛋白为i型胶原、ⅱ型胶原、ⅲ型胶原或ⅳ型胶原中的一种。3.根据权利要求1或2所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述胶原蛋白的加入量为培养基体积的1-10％。4.根据权利要求1所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述步骤
⑵
中按照10
5-106/ml的浓度重悬肉瘤细胞。5.根据权利要求1或4所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述肉瘤细胞是纤维肉瘤细胞或骨肉瘤细胞。6.根据权利要求1所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述脱细胞液是由1-4m尿素、0.2-2m硫酸铵、1-20mm edta和10-200mm乙酸组成。7.根据权利要求1所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述高速离心的条件是：4℃下12000rpm。8.根据权利要求1所述的一种基质胶的制备方法，其特征在于：所述透析液为1-20mm tris-hcl(ph＝7.0)。9.一种基质胶，其特征在于：是采用权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备而成。10.权利要求9所述的一种基质胶在类器官培养上的应用。
技术总结本发明涉及一种基质胶及其制备方法和应用，包括以下步骤：
技术研发人员：廖传荣 朱宇 邱培 黄敏
受保护的技术使用者：创芯国际生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2022.07.20
技术公布日：2022/11/1
