本发明属于生物，涉及一种sumo化修饰捕获探针、合成方法及应用，具体是指一种sumo化修饰捕获探针(sumo-n-甲基丙-2-炔-1-胺)(sumo-c4h7n)、其合成方法及在肿瘤检测中的应用。
背景技术：
1、乳腺癌是发生于乳腺腺体及导管的恶性肿瘤，是女性发病率最高的癌症，是当今世界人类疾病中最常见的发病和死亡原因之一，严重威胁着人类的生命和健康。因此乳腺癌的防治已是世界性的保健问题，是世界卫生组织重点防治的疾病。根据美国癌症协会acs的数据，在美国，10万人中乳腺癌发病率约为113.3人，在我国，乳腺癌的发病率正逐年上升，在许多大城市已高居女性肿瘤的首位，给社会和家庭带来巨大的财产损失和精神痛苦。
2、目前，乳腺癌的发病机理还不完全清楚，尚无有效预防措施。众所周知，大多数癌症包括乳腺癌的发生、发展是一个长时间的，慢性的病理变化过程，目前所用乳腺癌的诊断方法只能诊断出瘤体已长到一定体积的癌症，这在许多情况下，已为时过晚。当前乳腺癌的治疗仍以药物治疗、放疗以及手术切除为主，但至今还没有一种行之有效的诊断和治疗方法。手术虽然切除了肿瘤病灶，但也部分甚至全部切除了相应的组织器官，丧失了其正常的功能；而放疗在放射线杀伤肿瘤细胞的同时，也对机体正常组织细胞产生了损伤作用，很大程度限制了肿瘤治疗；药物治疗由于疗效不强和具有较强的毒副作用，而给患者遭成了极大的生理和心理创伤。和其他癌症一样，乳腺癌的有效预防和治疗也有待于弄清和阐明乳腺癌的发病机理，因此基因疗法就显得尤为重要。
3、小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,sumo)化修饰是一种重要的动态可逆性蛋白质翻译后修饰，从发现至今已有20余年。迄今已经有超过3000种的sumo化修饰的蛋白质被发现确认，并且sumo化修饰对靶蛋白的功能具有重要的调节作用，如细胞亚定位、蛋白质稳定性、信号转导、酶活性、基因转录调控、细胞周期调节、细胞分化等。目前，在哺乳动物中，已经鉴定出4种不同的sumo蛋白亚型，分别是sumo-1、sumo-2、sumo-3和sumo-4，sumo分子在e1活化酶、e2结合酶和e3连接酶的参与下，其c端的双gly与靶蛋白上赖氨酸侧链ε-nh2通过异肽键共价结合，调控底物蛋白的结构与功能。例如，p53的sumo化修饰发生在第386位的赖氨酸残基上，并且pias(protein inhibitor of activatedstats)家族成员可以增强p53的稳定性，同时也有研究证实sumo化能增强p53的转录活性，进而导致细胞凋亡。pten(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-3-phosphatase)蛋白的第254、266和289位的赖氨酸残基可以被sumo-1和sumo-2修饰，下调pi3k/akt通路，进而抑制细胞的增殖和肿瘤的生长。多个与p53相互作用的蛋白质可以被sumo化，nf-κb、pten等信号通路的核心因子在肿瘤发生发展中的作用至少部分依赖sumo蛋白的活性。因此sumo化是未来癌症检测和治疗最有潜力的靶标之一。通过研究相关sumo荧光探针，了解肿瘤发生发展过程中sumo化水平的动态变化，能够为肿瘤的早期诊断和治疗开辟新的思路。
4、蛋白质的sumo化修饰是一个动态且可逆的过程，因此去sumo化酶被认为是药物治疗靶标。去sumo化酶(dsp)是由一组sumo特异性蛋白酶家族senp(sentrin/sumo-specificprotease)，senps能够调控靶蛋白的sumo化修饰水平及活性，同时其自身的表达或活性也被一些调控因子所调节。通过序列比对，发现senps均具有200个氨基酸左右的酶活性区域，属于c48半胱氨酸蛋白酶，能够切断sumo与靶蛋白间的异肽键，根据dsp的这一特性，设计一种靶向dsp活性中心的半胱氨酸的分子探针，能够特异性地识别并共价结合半胱氨酸，而不切断sumo与靶蛋白间的异肽键，使其不会发生去sumo化反应。
5、由于sumo化修饰是一个动态的过程，因此对于细胞内sumo化修饰的定位及动态修饰检测非常困难，目前急需要一种检测手段对sumo化修饰进行精确定位和动态监测。特别是在一些肿瘤细胞中，sumo化修饰程度的高低与肿瘤的恶性程度及预后密切相关，因此对于sumo化修饰的细胞定位，定量分析以及动态修饰变化的追踪将有助于恶性肿瘤的诊断和预后评估。
技术实现思路
1、为了解决sumo化检测中的问题，本发明提供了一种sumo化修饰捕获探针，该探针可快速检测细胞内sumo化修饰蛋白的亚细胞定位、修饰程度以及动态修饰的变化过程。
2、本发明的技术方案为：
3、一种sumo化修饰捕获探针，其分子式为sumo-c7h13no2，结构式如下式(i)所示：
4、
5、所述的sumo为人源sumo-1，其核苷酸序列如seq id no：1所示，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
6、上述的sumo化修饰捕获探针的制备方法，包括以下步骤：
7、步骤1、通过基因克隆，得到人源sumo的全长cdna序列；
8、步骤2、将步骤1得到的含有sumo全长cdna序列质粒，通过在大肠杆菌中重组表达sumo蛋白多肽，并通过亲和纯化，得到纯品sumo蛋白多肽；
9、步骤3、将步骤2得到的纯品sumo蛋白多肽，通过全化学合成方法，得到sumo-c4h7n荧光探针。
10、所述的步骤3具体如下：
11、步骤3.1)将苯并噻唑-2-甲酸乙酯(3.5g，14.5mmol)溶解于dmso(60ml)，然后加入水合肼(质量分数为70％，1.1ml，35.2mmol)，回流至完全反应，将体系冷却至室温。
12、步骤3.2)将步骤3.1)中反应产物加入去离子水搅拌半个小时，淬灭反应。
13、步骤3.3)将步骤3.2)中反应产物加入苯硫酚溶液，调整至最终ph为8.5；其中，苯硫酚溶液是将苯硫酚溶解于二甲基亚砜中，苯硫酚的体积分数为2％。
14、步骤3.4)将步骤3.3)获得的混合物溶于由tfa和dcm按照体积比为1:1混合的溶液中，室温搅拌1h，tlc监测，真空浓缩有机相，残渣在真空下干燥过夜。
15、步骤3.5)通过旋转蒸发仪将步骤3.4)中有机溶剂旋干后，用dmso重结晶，最后获得淡黄色色固体粉末，质谱检测。
16、步骤3.6)氨基水解boc保护的sumo1-mesna：将sumo1-mesna(8.8mg,3.33mm)和boc2o(3.6μl,53mm)溶于300μl的dmso中。然后加入1.6μl的diea，室温搅拌1h，加入冷乙醚沉淀出boc保护的sumo1-mesna。随后，将醚沉淀物溶于500μl的dmso中。然后加入5ml苯硫酚溶液，其中，苯硫酚溶液是将苯硫酚溶解于二甲基亚砜中，苯硫酚的体积分数为2％。此外，还需要添加diea作为引发剂，并在37℃下进行反应。用冰醚沉淀有机相，2h后干燥。然后用标准裂解试剂(体积比tfa:tis:h2o＝95:2.5:2.5)去除sumo段中的boc基团，用冷醚沉淀和离心得到粗产品。
17、步骤3.7)将4g步骤3.5)中得到淡黄色粉末(15.6mmol)、2mg步骤3.6)所得产品混合，加入30ml甲苯、20ml k2co3水溶液(2m)和10ml无水乙醇混合溶剂。反应容器用n2密封后，置于摇床中，在50℃、150rpm下反应48h，获得sumo1-nhnh2。
18、步骤3.8)将步骤3.7)所得sumo1-nhnh2(1mm)溶于缓冲液中，其中，缓冲液中含有6.0m gnhcl和0.2m na2hpo4，ph为3.0。在冰盐浴(-10～-20℃)中预冷搅拌后，加入0.5g的nano2至反应缓冲液中20min，然后直接加入50ml的mesna(50mm)，调节ph至5.0。在室温下搅拌反应混合物20-30分钟。经胰蛋白酶切后，lc-ms鉴定，获得sumo-c4h7n荧光探针。
19、本发明的sumo化修饰捕获探针检测sumo化修饰的用途，包括sumo化修饰的细胞定位、定量分析和/或动态修饰变化分析，这些特性用于在制备用于癌症诊断和/或预后的试剂中。
20、本发明采用基因克隆得到编码人源sumo-1蛋白的多肽，通过化学合成方法得到sumo-c4h7n结构稳定，方便化学合成及检测应用，sumo-c4h7n荧光探针具有高度特异性灵敏性较高。
1.一种sumo化修饰捕获探针，其特征在于，所述的sumo化修饰捕获探针分子式为sumo-c7h13no2，结构式如下式(i)所示：
2.权利要求1所述的sumo化修饰捕获探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的步骤3具体如下：
4.权利要求1所述的sumo化修饰捕获探针应用于检测sumo化修饰。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的检测sumo化修饰包括sumo化修饰的细胞定位、定量分析和/或动态修饰变化分析。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，sumo化修饰捕获探针用于制备用于癌症诊断和/或预后的试剂。
