一种用于bax mrna检测的拉曼-荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于纳米材料和生命科学技术领域，尤其涉及一种用于bax mrna检测的拉曼-荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术：2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，又名呕吐毒素，属于单端孢霉烯族类化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生，在自然界中广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮食及其制品中，是最常见的真菌毒素之一。中国传统饮食习惯中粮谷比例远远高于西方，使得don的危害更为突出。don具有很强的细胞毒性，可以抑制dna、rna和蛋白质的合成，抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。其中诱导细胞凋亡是don发挥致病作用，产生免疫毒性的重要途径之一，也是近年来霉菌毒素研究领域中的热点问题。
3.细胞凋亡主要通过三条途径发生：死亡受体信号通路、线粒体介导的细胞凋亡信号转导途径以及内质网介导的细胞凋亡信号转导途径。研究表明线粒体是单端孢霉烯族毒素毒性作用的靶细胞器。单端孢霉烯族毒素可诱导线粒体产生过多的ros，激活线粒体凋亡途径。
4.线粒体凋亡途径由促进凋亡和抑制凋亡的两类基因共同控制，目前研究聚焦于bcl-2家族。bax是bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，其高表达可拮抗bcl-2对细胞的保护效应而使细胞趋于死亡。研究表明，bax是极关键的促细胞凋亡因子之一，因此，了解bax mrna在细胞通路中的作用并追踪其在细胞内的动态变化是非常必要的。
5.目前，细胞内bax mrna的测定方法包括rt-pcr和琼脂糖凝胶电泳法、northernblot分子杂交技术、原位杂交法、实时荧光定量pcr等。电泳法条带易染色，图谱清晰，分辨率高，重复性好，样品易洗脱，便于定量测定，但机械强度差，易破碎，易被污染，而且配制凝胶时所用的eb是有一定毒性的，实验时需注意。northern blot分子杂交技术技术相对简单，成本较低，主要检测rna表达数量，无法得知其在细胞组织中的分布情况。原位杂交法主要可以检测到rna表达的分布情况，但技术复杂、步骤较为繁琐、试验费用较高。而实时荧光定量pcr法因能实时监测pcr反应的进程，有效地解决传统定量只能终点检测的局限而被广泛使用，但其对实验操作人员要求较高，步骤繁琐，对提取rna样品有纯度要求。
6.表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman spectroscopy，sers)是一种分子振动光谱技术，它通过构建sers增强基底，即把分子吸附在粗糙金属或金属溶胶颗粒表面上，可将其拉曼信号强度放大十几个数量级，从而获得丰富的分子结构特征和物质成分信息。对于细胞和组织等生物样品来说是一种理想的无损分析手段。由于具有优异的光学性质、生物相容性和低毒性，金纳米材料在构建表面拉曼光谱散射或荧光生物传感器方面具有广阔的发展前景。近年来，借助新型识别分子，例如功能核酸，将其与纳米材料结合，能广泛应用于细胞内检测及原位成像。sers技术虽具有高灵敏度，但较易被外界物质干扰造成假阳性信号，因此开发高特异性高稳定性sers探针仍需深入研究探索。
技术实现要素：7.针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于bax mrna检测的拉曼-荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用。本发明的一种双模式纳米探针，包括纳米金三角片、bax mrna特异性识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(sh-mpeg)、细胞穿膜肽(tat)，所述bax mrna特异性识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(sh-mpeg)、细胞穿膜肽(tat)包裹在纳米金三角片表面；锚定链和酶识别链部分互补；识别链的5’端或3’端修饰荧光基团，锚定链的5’端或3’端修饰巯基；锚定链通过au-s共价键与纳米金三角片连接。
8.本发明通过以下技术方案实现的：
9.本发明的第一个目的在于提供一种用于bax mrna检测的拉曼-荧光双模式纳米探针，所述拉曼-荧光双模式纳米探针包括锚定链、与所述锚定链互补配对的bax mrna特异性识别链以及纳米金三角片；所述锚定链通过au-s共价键与纳米金三角片连接；所述锚定链的5’端或3’端修饰巯基；所述bax mrna特异性识别链的5’端或3’端修饰荧光基团。
10.本发明的锚定链、sh-mpeg和tat牢固地包裹在纳米金三角片表面，阻止纳米金三角片之间的相互接触和聚集，tat小分子补充占据锚定链和sh-mpeg未占据的位点，提高双模式纳米探针的稳定性，使其更易进入细胞。
11.在本发明的一个实施例中，所述锚定链的核酸序列为5
’‑
sh-aaaaaaccctggacccggtgcctcag-3’；
12.所述bax mrna特异性识别链的核酸序列为5
’‑
catcctgaggcaccgggtccagggt-3’。
13.在本发明的一个实施例中，所述荧光基团选自cy5、cy5.5、cy3或rox。
14.在本发明的一个实施例中，所述纳米金三角片的粒径为60nm-80nm；在金的尖锐处能产生很高的电场效应，具有很好的表面增强拉曼效应。
15.在本发明的一个实施例中，所述锚定链、bax mrna特异性识别链和纳米金三角片的金的摩尔比为9-10:2-4:510-520。
16.本发明的第二个目的在于提供一种所述的拉曼-荧光双模式纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)将活化后的锚定链与经表面配体稳定后的纳米金三角片混合反应，加入氯化盐孵育，得到含锚定链的纳米金三角片；
18.(2)将步骤(1)所述的含锚定链的纳米金三角片与bax mrna特异性识别链溶液混合孵育，固液分离取固相，将所得固相重悬于缓冲液中，并加入细胞穿膜肽继续孵育，固液分离取固相，得到所述拉曼-荧光双模式的纳米探针。
19.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述活化后的锚定链溶液通过以下方法制备得到：向锚定链溶液中加入硫醇类还原剂进行反应，得到所述活化后的锚定链溶液。
20.在本发明的一个实施例中，所述硫醇类还原剂选自tcep或dtt；加入硫醇类还原剂的目的是剪切锚定链之间形成的双巯键。
21.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述经表面配体稳定后的纳米金三角片通过以下方法制备得到：将纳米金三角片与表面配体孵育，固液分离取固相，得到所述经表面配体稳定后的纳米金三角片。
22.在本发明的一个实施例中，所述表面配体选自mpeg-sh。
23.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述混合反应的条件为：35℃-40℃下震荡
反应3h-5h。
24.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述氯化盐选自氯化钠。
25.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，氯化钠的终浓度为200mm-400mm。通过添加适当浓度的氯化钠完成核酸链“老化”，来稳定dna链的结构、减小核酸链链之间的斥力，使dna更容易接到aunts上。核酸周围高浓度的盐环境阻止了核酸酶对dna的降解，从而保护了双模式纳米探针的稳定性。
26.在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述锚定链溶液的浓度为40μm-60μm。
27.在本发明的一个实施例中，在步骤(2)中，bax mrna特异性识别链溶液的浓度为30μm-50μm。
28.本发明的第三个目的在于提供所述的纳米探针在定量或定性检测bax mrna中的应用。
29.本发明的第四个目的在于提供一种非诊断非治疗为目的的bax mrna的检测方法，包括以下步骤：
30.将所述的拉曼-荧光双模式纳米探针与待测细胞于培养基中共培养，后加入含有毒素的基本培养基共培养，之后将培养结束的细胞染色和固定，检测拉曼信号值或荧光信号值，得到细胞内bax mrna的检测结果；
31.或将所述的拉曼-荧光双模式纳米探针与含bax mrna的溶液混合反应，离心后检测拉曼信号值或荧光信号值，得到体外bax mrna的检测结果。
32.在本发明的一个实施例中，一种非诊断非治疗目的的bax mrna双模式检测方法，包括以下步骤：
33.将拉曼-荧光双模式纳米探针混匀在基本培养基中，与待测细胞共培养11h-13h后，吸出基本培养基并用pbs清洗，加入含有毒素的基本培养基共培养1h-6h，吸出基本培养基并清洗，将细胞染色和固定，进行sers光谱检测、sers成像和荧光成像，得到细胞内bax mrna的检测结果；
34.或将拉曼-荧光双模式纳米探针与含靶标链的溶液混合反应，离心后进行sers光谱检测、sers成像或荧光成像，得到体外bax mrna的检测结果。
35.在本发明的一个实施例中，所述细胞选自人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg2、人正常肝细胞qsg-7701和人结直肠腺癌细胞caco-2中的一种或多种。
36.在本发明的一个实施例中，所述毒素选自don毒素或t-2毒素。在毒素诱导下细胞开始凋亡，相较于正常情况下，胞质内bax mrna增加，以此实现对胞内凋亡过程中bax mrna的监测。含有毒素的基本培养基中，毒素浓度优选对应培养时间下的ic
50
值。此浓度可确保毒素对待测细胞产生一定毒性，并保持一定的细胞存活率。
37.在本发明的一个实施例中，don毒素的浓度为50μm-150μm，优选100μm。
38.在本发明的一个实施例中，双模式纳米探针与基本培养基混匀时，所述培养基中最终au元素的浓度为70μm-100μm，优选80μm。此浓度可维持更高的细胞活性并取得更好的检测效果。
39.在本发明的一个实施例中，基本培养基选自dmem基本培养基。
40.在本发明的一个实施例中，纳米金三角片由以下步骤制备得到：
41.(1)将氯金酸溶液与十六烷基三甲基氯化铵(ctac)溶液混合均匀，加入新鲜预冷
的硼氢化钠溶液剧烈搅拌，静置后得到金种子溶液；
42.(2)将氯金酸溶液、碘化钠溶液和ctac溶液混合均匀，加入抗坏血酸溶液，得到生长液；
43.(3)将金种子溶液稀释后快速加入生长液中搅拌、静置、过夜纯化得到纳米金三角片。
44.本法明的原理如下：
45.本发明的检测方法基于表面增强拉曼散射(sers)和荧光共振能量转移(fret)的“开-关”转换。通过在aunts上组装锚定链及其部分互补的修饰荧光基团的bax mrna特异性识别链构建拉曼-荧光双模式纳米探针，aunts的紫外吸收峰与荧光基团的发射光谱部分显著重叠，因此aunts可以淬灭其荧光。双模式纳米探针能够进入细胞中，当细胞中存在bax mrna时，荧光基团标记的特异性识别链脱离锚定链，被释放出来，与bax mrna形成新的双链，实现荧光信号的增强和拉曼信号的减弱，从而实现对bax mrna双重信号的检测。
46.本发明的技术方案具有以下优点：
47.(1)本发明通过制备高性能的纳米探针(dna2-dna1-aunts)，利用核酸链与金纳米材料表面的au-s键相互作用实现成功构建，结合反义寡核酸链对目标物的特异性识别作用为bax mrna的检测设计了一种高灵敏的拉曼-荧光双模式纳米探针。
48.(2)本发明的拉曼-荧光双模式纳米探针中核酸链、sh-mpeg和tat牢固地包裹在纳米金三角片表面，阻止纳米金三角片之间的相互接触和聚集，提高双模式纳米探针的稳定性，tat小分子补充占据核酸链和sh-mpeg未占据的位点，使其更易进入细胞。
49.(3)在aunts的合成过程中，添加氯化钠来完成dna与aunts的连接，核酸周围高浓度的盐环境阻止了核酸酶对dna的降解，从而保护了拉曼-荧光双模式纳米探针的稳定性，使其能在细胞内环境中应用。
50.(4)本发明提供一种拉曼-荧光双模式纳米探针，将荧光与sers信号连接到同一纳米粒子上，使该粒子同时具有荧光和sers成像能力。其不仅能通过荧光信号进行快速定位和成像，而且可利用sers技术进行多目标跟踪和定量研究。此双模检测系统能消除细胞内环境影响，有效解决荧光和sers成像技术存在的假阳性干扰问题。
51.(5)本发明结合了拉曼和荧光的双重优点，探针在进入细胞后，由于最初的荧光信号被猝灭，荧光背景信号很弱，随着细胞凋亡进行，荧光信号恢复，可更直观地反映和监测bax mrna浓度增加的过程，从而实现细胞凋亡过程中bax mrna变化的实时监测，制备简单，性质稳定，生物相容性高。
52.(6)本发明基于寡核苷酸置换的拉曼-荧光双模式纳米探针，不仅对bax mrna有优异的选择性和灵敏度，而且可以实现对细胞凋亡过程中bax mrna变化的实时监测，有利于了解bax mrna信号在细胞通路中的作用。
53.(7)本发明的双模式纳米探针对细胞低毒无损伤，易于载入细胞，合成成本与检测成本低。
附图说明
54.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
55.图1为本发明实施例1制备的aunts的表征图；图1-a为aunts的tem电镜图；图1-b为aunts的紫外-可见吸收光谱图；图1-c为aunts粒径的统计图；
56.图2为本发明实施例1中锚定链(dna1)浓度的优化结果图；
57.图3为本发明实施例2中识别链(dna2)浓度的优化结果图；
58.图4为本发明实施例2中识别链(dna2)浓度的优化结果图；其中图4-a为识别链浓度优化的拉曼强度图；图4-b为识别链浓度优化的拉曼光谱表征图；
59.图5为本发明实施例3中双模式纳米探针的稳定性测试结果图；其中图5-a为纳米探针修饰前后的紫外可见吸收光谱仪的检测图；图5-b为纳米探针的核酶和谷胱甘肽稳定性图；图5-c为纳米探针在缓冲液以及培养基中的稳定性；图5-d为纳米探针的ph稳定性图；
60.图6为本发明实施例4中双模式纳米探针用于体外bax mrna拉曼光谱图；
61.图7为本发明实施例4中在1361cm-1
处的sers强度的线性关系图；
62.图8为本发明实施例4中双模式纳米探针用于体外bax mrna在665nm处的荧光强度检测结果图；
63.图9为本发明实施例4中双模式纳米探针拉曼信号的选择性结果图；
64.图10为本发明实施例4中双模式纳米探针荧光信号的选择性结果图；
65.图11为本发明实施例5中不同浓度的don毒素(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、150μg/ml)侵染hepg2细胞结果图；
66.图12为本发明实施例6中不同金含量aunts(20nm、40nm、80nm、160nm、240nm、480nm)的双模式纳米探针与hepg2细胞共培养不同时间的细胞毒性图；
67.图13为本发明实施例7中hepg2细胞对双模式纳米探针的摄取tem成像图；
68.图14为本发明实施例8中hepg2细胞的icp-ms分析图；
69.图15为本发明实施例9中双模式纳米探针用于活细胞中的激光共聚焦成像图；
70.图16为本发明实施例9中双模式纳米探针用于活细胞中的荧光强度图；
71.图17为本发明实施例10中双模式纳米探针用于活细胞中的sers成像图；
72.图18为本发明实施例10中双模式纳米探针用于活细胞中的sers光谱检测图；
73.图19为本发明实施例11中don毒素刺激后细胞的q-pcr结果图；
74.图20为本发明实施例11中don毒素刺激后细胞的sers光谱检测结果图；
75.图21为本发明实施例12中双模式纳米探针在不同细胞系中的bax mrna荧光成像图；
76.图22为本发明实施例12中双模式纳米探针在不同细胞系中的bax mrna sers成像图；
77.图23为本发明实施例12中双模式纳米探针在被don毒素刺激0h的不同细胞系中sers光谱图；
78.图24为本发明实施例12中双模式纳米探针在被don毒素刺激3h的不同细胞系中sers光谱图。
具体实施方式
79.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
80.实施例1
81.(1)将50μl 25mm的haucl4溶液加入到4.7ml的0.1m ctac溶液中，在剧烈搅拌下注入300μl新鲜制备的预冷的10mm nabh4溶液，在室温下静置2h，得到金种子溶液。以0.1m ctac溶液将其稀释10倍备用。
82.(2)生长液1：将1.6ml 0.1m ctac溶液加至8ml超纯水中，然后加入40μl 50mm haucl4和15μl10 mm nai；生长液2：将500μl 50mm haucl4加至40ml 0.05m ctac中，然后加入300μl 10mm nai。
83.(3)将40μl和400μl的0.2m抗坏血酸溶液分别加入到生长液1和生长液2中，搅拌至两种溶液由浅黄色变为完全透明。随后将100μl稀释后的金种子溶液加入到生长液1中，搅拌不超过5s后，立即将3.2ml该溶液加入到生长液2中并搅拌5s，在室温下静置1h后继续向生长液2中添加5ml25％ctac溶液用以纯化。纯化过夜后吸除紫色上清液，5000rpm下离心5min得到aunts溶液，重悬于5ml 0.05％的吐温20(tween-20)中。
84.(4)为了稳定纳米材料，对其进行表面修饰和改性，取1ml步骤(3)制备的aunts溶液加入50μl 50μm mpeg-sh溶液，涡旋30s后在孵育器中孵育1h(350rpm，37℃)，加入1ml 0.05％tween-20溶液后离心(7200r/10min)，吸去上清液。再加入1ml 0.05％tween-20溶液以及50μl 50μm m peg-sh溶液，涡旋30s后孵育5min，离心(7200r/10min)，吸去上清液，重复两次后，所得沉淀为纳米金三角片，并将其重悬于0.05％吐温20溶液中。用tem电镜图和紫外-可见吸收光谱图对纳米金三角片进行表征，结果如图1所示；其中图1-a为tem电镜图，图1-b为紫外-可见吸收光谱图。图1-c为aunts粒径的统计图。
85.(5)取50μl2 mm的tcep溶液与50μl 50μm的锚定链溶液混合，在室温下活化2h。加入550μl步骤(4)制备的纳米金三角片溶液于37℃下震荡反应4h，加入1％tween-20溶液后，分多次加2mnacl溶液至其终浓度达到0.3mm，在孵育器(200rpm，37℃)中孵育12h。然后将溶液进行三次离心洗涤(7000rpm，10min)，并重悬于含有0.01％tween-20的pbs缓冲液(0.01m，ph 7.4)中，得到表面修饰上锚定链的纳米金三角片(dna1-aunts)。
86.为了获得最大的负载量，更改锚定链(dna1)溶液浓度分别为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm以便进行优化，以离心后上清液在260nm处吸光度的下降(δa260)证明纳米颗粒被dna修饰。dna1-aunts溶液在260nm处吸光度的下降(δa260)结果如图2所示。
87.由图1-a可看出，合成的aunts粒径均一，外观为三角形；由图1-b可知，aunts的紫外吸收峰在650nm左右，与cy5的发射光谱存在部分显著重叠，这表明aunts可以淬灭cy5的荧光；由图1-c显示，aunts平均粒径为69.92nm。
88.由图2可以看出随着dna1-aunts浓度的增加，δa260显著增加。当浓度达到5μm时，δa260几乎不变。因此确定dna1-aunts的最优浓度为5μm。
89.实施例2识别链(dna2)与dna1-aunts的杂交实验
90.将一定浓度的识别链溶液(dna2)添加到实施例1中制备的dna1-aunts溶液中。混合液在37℃下孵育12h后经多次离心(7000rpm，10min)以除去多余的识别链，重悬于含有0.01％tween-20的pbs缓冲液(0.01m，ph 7.4)中。为稳定纳米探针，向溶液中加入20μm tat，将混合物在37℃下孵育1h，反复离心后重悬于含有0.01％tween-20的pbs缓冲液(0.01m，ph 7.4)中以得到双模式纳米探针(dna2-dna1-aunts)。
91.为了获得最大的负载量，更改识别链溶液浓度分别为0.1μm、0.3μm、0.5μm、0.6μm、
0.8μm、1μm、1.2μm、1.5μm和2μm以便进行优化，以cy5基团的荧光信号猝灭和拉曼信号增强来证明dna2链与dna1-aunts链的杂交，结果如图3和图4所示。
92.由图3可以看出，随着识别链浓度的增加，杂交前后系统上清液荧光强度降低值逐渐增加，当浓度达到1.5μm后几乎保持不变；由图4可以看出，随着识别链浓度的增加，cy51361 cm-1
处的特征峰sers强度显著增加。当浓度达到1.5μm时，特征峰强度大致保持不变。因此，确定识别链的最优浓度为1.5μm。
93.实施例3双模式纳米探针的稳定性实验
94.(1)紫外可见光谱表征双模式纳米探针的盐稳定性
95.将制得的双模式纳米探针离心后重悬于含有不同nacl浓度(200mm、300mm、400mm、500mm)的pbs缓冲液中，涡旋混匀，静置10min后，通过紫外可见吸收光谱仪检测双模式纳米探针光谱的变化，结果如图5-a所示。
96.(2)荧光实验评估双模式纳米探针的核酶和谷胱甘肽稳定性
97.细胞内存在多种酶和巯基化合物，能切割核酸或者竞争巯基化核酸，因此探针稳定性是确保细胞内实验结果准确的重要前提条件。将两组纳米探针置于37℃下的96孔荧光板中，待样品溶液稳定平衡10min后，一组加入dnase i，使其终浓度为1u/ml，另一组加入谷胱甘肽(gsh)，使其终浓度为5mm，连续监测样品的荧光强度，结果如图5-b所示。
98.(3)拉曼实验评估双模式纳米探针在缓冲液以及培养基中的稳定性
99.将两组双模式纳米探针离心后分别重悬于pbs缓冲溶液(0.01m，ph 7.4)以及dmem基本培养基中孵育0h、8h、16h和24h，检测cy5 sers信号的变化，结果如图5-c所示。
100.(4)紫外可见光谱表征双模式纳米探针的ph稳定性
101.将制得的双模式纳米探针离心后重悬于含有不同ph值(ph＝5、6、7、8、9)的pbs缓冲液中，涡旋混匀，静置10min后，通过紫外可见吸收光谱仪检测双模式纳米探针光谱的变化，结果如图5-d所示。
102.由图5-a和图5-d可以看出，在不同浓度的nacl溶液和不同ph值的pbs溶液中，双模式纳米探针的吸收峰位于650nm波长处，光谱强度变化不明显。核酸、peg牢固地包裹在纳米金三角片表面，阻止了纳米金三角片之间的相互接触和聚集，提高了双模式纳米探针的稳定性。
103.由图5-b可以看出，双模式纳米探针在高浓度dnase i、gsh存在的情况下，荧光信号会有少部分恢复，但探针的降解情况在可接受范围内，这也是基于au-s键的核酸生物传感器的常见缺陷。aunts对dna链的保护作用使其被替换或切割得比较缓慢，但纳米探针对靶标链反应显著且迅速。在aunts的合成过程中，添加氯化钠来完成dna与aunts的连接，核酸周围高浓度的盐环境阻值了核酸酶对dna的降解，从而保护了双模式纳米探针的稳定性。
104.由图5-c可以看出，缓冲溶液和培养基中的各种物质对双模式纳米探针的稳定性影响不大。
105.实施例4双模式纳米探针用于体外bax mrna检测
106.将不同浓度的靶标链溶液添加到实施例2制备的双模式纳米探针溶液中。在37℃的温度下反应3h，离心后测量sers光谱和荧光光谱，结果分别如图6、图7和图8所示。离心后的上清液用638nm波长下的激发光激发，在665nm处收集荧光强度的数据，结果如图8所示。沉淀重悬后，用于sers光谱检测，其中激发波长为633nm，扫描范围为1000cm-1
至1800cm-1
之
间，拉曼光谱结果如图6所示，cy51361 cm-1
处的特征峰拉曼值如图7所示。对于实际环境和细胞样品中可能存在的类似干扰物质(1nm)和重要生物成分(1mm)分别用拉曼和荧光手段进行特异性检测，mrna的类似物包括t
p53
、t
pten
、t
baxmismatched t
vegf
、t
hcv
、t
mir-21
、t
bcl-2
、t
p21
；重要生物成分包括牛血清蛋白(bsa)、抗坏血酸(aa)、赖氨酸(lys)、氯化镁(mgcl2)结果如图9和图10所示。
107.由图9和图10显示，含有靶标链的传感器的sers强度显著低于其他对照组，荧光强度显著高于其他对照组，由此证明本发明的sers-荧光双模式纳米探针具有优异的选择性。
108.实施例5don毒素的细胞毒性检测
109.采用cck-8法确定don毒素与细胞共培养的最佳浓度。将don毒素溶于dmso中并用细胞培养液稀释成不同浓度，染毒时dmso浓度控制在0.5％以下(在浓度为0.5％以内，dmso对hepg2细胞存活率无明显影响)。将生长对数期的hepg2细胞消化下来制备成细胞悬液，以10000个/ml密度接种100μl细胞悬液于96孔板中。将培养板放在培养箱预培养24h(37℃，5％co2)后，向培养板加入10μl不同浓度的待测物质，使培养基中don毒素的最终浓度分别为0μm、5μm、10μm、20μm、40μm、80μm、100μm、120μm、150μm。将培养板在培养箱孵育6h后，向每孔加入10μlcck-8溶液。培养箱内孵育4h后，测定450nm处的吸光度。利用下述公式计算细胞相对存活率：
110.细胞相对存活率(rgr)＝(实验组吸光值-cck8本底)/(对照组实验值-cck8本底)
×
100％，结果如图11所示。通过origin软件拟合don毒素对hepg2细胞的ic
50
，结果如图11中插图所示。
111.由图11可见，随着don毒素浓度增加，hepg2细胞活力也依次降低。通过插图可知，don毒素对hepg2细胞的ic
50
值约为100μm，此浓度可确保don毒素对hepg2细胞产生一定毒性，并保持一定的细胞存活率。
112.实施例6cck-8法评测双模式纳米探针的细胞毒性
113.将生长对数期的hepg2细胞消化下来制备成细胞悬液，以10000个/ml密度接种100μl细胞悬液于96孔板中，在37℃，5％co2空气条件下孵育24h使细胞充分贴壁，之后弃去旧的培养基，用pbs清洗三次，然后加入金含量分别为40nm、80nm、160nm、240nm、480nm的探针孵育，同一浓度下的细胞孵育时间又分别设置为6h、12h、24h。弃去探针溶液，并用pbs冲洗三次，然后每孔中加入100μl cck-f试剂，培养箱内孵育30min后，在494nm(激发)和517nm处测量荧光强度，以未经处理细胞为对照组，计算出不同探针浓度、不同作用时间下的细胞活性，结果如图12所示。
114.由图12可知，金含量为480nm的纳米探针刺激细胞24h，也可维持hepg2细胞活性在80％以上。
115.实施例7tem成像观察hepg2细胞对双模式纳米探针的摄取
116.hepg2细胞被接种到6孔板中，分别与金含量80nm的双模式纳米探针孵育12h。之后将细胞酮(50％、70％、90％、100％)脱水，用纯丙酮和包埋液进行浸泡、包埋处理，再用37℃和60℃烘箱固定，最后切片染色拍片，结果如图13所示。
117.由图13表明，双模式纳米探针能够进入hepg2细胞中，并且主要以单个或多个的形式分布在细胞质中。
118.实施例8icp-ms分析进入细胞中双模式纳米探针数量
119.为了进一步验证细胞中确实己经吞入双模式纳米探针，用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)对与探针孵育后细胞中的金元素含量进行了定量分析。具体做法如下：将hepg2细胞接种到6孔板中，贴壁生长24h，然后加入金含量80nm浓度的双模式纳米探针，与细胞共同孵育不同时间(1h、2h、4h、8h和12h)后，弃去培养基，用pbs缓冲清洗数遍后，加入胰酶使hepg2细胞从皿底脱落，计数后离心收集。加入王水消化细胞，超声，孵育一整晚后，稀释40倍，进入icp-ms分析，计算出进入细胞中双模式纳米探针的数量，结果如图14所示。
120.由图14可知，hepg2细胞对双模式纳米探针的吸收在大约8h-12h达到饱和。
121.实施例9双模式纳米探针用于活细胞荧光成像
122.待细胞生长到对数生长期后，将细胞按3
×
104个/ml的密度接种500μl到激光共聚焦专用小皿上，细胞培养至贴壁后并用pbs清洗数次，吸出旧培养基，加入混匀探针的dmem培养基与细胞共培养12h，吸出含有探针的培养基并用pbs清洗，然后用dapi染色5min，弃去dapi并用pbs清洗数次后，加入混有100μm don毒素的基本培养基，分别共培养0h、1h、2h、3h、4h、6h；反应完成后，吸出培养基并用pbs清洗数次后，并用4％的多聚甲醛固定细胞，然后马上进行荧光成像，其荧光强度在激发波长633nm下确定，结果如图15和图16所示。
123.由图15和图16可知，随着与don毒素孵育时间的增加，荧光强度增加。
124.实施例10活细胞中bax mrna的定量检测
125.使用总rna抽提试剂盒从don毒素处理过的细胞中提取总细胞rna，然后使用hiscript试剂盒的逆转录反应制备cdna样品。使用qpcr试剂盒进行cdna的qpcr分析。检测条件如试剂盒所示。以gapdh为内参并使用2-δδct
方法评估bax mrna，结果如图17和图18所示，其中图17为don毒素刺激后细胞的q-pcr结果；图18为don毒素刺激后细胞内bax mrna浓度。
126.由图17和图18可以看出随着与don毒素孵育时间的增加，细胞凋亡程度加深，胞内bax mrna含量增加。
127.实施例11活细胞的拉曼检测和成像
128.培养细胞至生长对数期后，将细胞按3
×
104个/ml的密度接种500μl到激光共聚焦专用养基与细胞共培养12h，吸出含有探针的培养基并用pbs清洗，然后加入混有100μm don毒素的基本培养基，分别共培养0h、1h、2h、3h、4h、6h；反应完成后，吸出培养基并用pbs清洗数次后，并用4％的多聚甲醛固定细胞15min，马上进行sers光谱检测和sers成像。对于sers成像，激光激发为633nm。将cy51361cm-1
处的特征峰作为sers成像的位点，结果如图19所示，sers光谱检测结果如图20所示。
129.由图19和图20可以看出，随着细胞内bax mrna的增加，hepg2细胞的红色视野逐渐减小，这与sers光谱的结果一致。
130.实施例12双模式纳米探针用于hela、qsg-7701、caco-2不同细胞系的通用性检测
131.选择人宫颈癌细胞hela、人正常肝细胞qsg-7701和人结直肠腺癌细胞caco-2以确定双模式纳米探针在人相关细胞中应用的通用性。探针分别与hela、qsg-7701、caco-2孵育12h后，荧光信号和cy5的sers信号分别如图23和图24所示。将don毒素与hela、qsg-7701、caco-2共孵育3h后，进行sers成像和激光共聚焦成像，孵育前后的结果分别如图21和图22所示。
132.由图21-图24所示，cy5的sers信号较强，荧光信号很弱，3h的细胞内荧光强度明显
增加，红色视野逐渐减小，这也与sers光谱的结果一致。
133.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
技术特征：1.一种用于bax mrna检测的拉曼-荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述拉曼-荧光双模式纳米探针包括锚定链、与所述锚定链互补配对的bax mrna特异性识别链以及纳米金三角片；所述锚定链通过au-s共价键与纳米金三角片连接；所述锚定链的5’端或3’端修饰巯基；所述bax mrna特异性识别链的5’端或3’端修饰荧光基团。2.根据权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述锚定链的核酸序列为5
’‑
sh-aaaaaaccctggacccggtgcctcag-3’；所述bax mrna特异性识别链的核酸序列为5
’‑
catcctgaggcaccgggtccagggt-3’。3.根据权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述荧光基团选自cy5、cy5.5、cy3或rox。4.根据权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述锚定链、bax mrna特异性识别链和纳米金三角片的金的摩尔比为9-10:2-4:510-520。5.如权利要求1中所述的拉曼-荧光双模式纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将活化后的锚定链与经表面配体稳定后的纳米金三角片混合反应，加入氯化盐孵育，得到含锚定链的纳米金三角片；(2)将步骤(1)所述的含锚定链的纳米金三角片与bax mrna特异性识别链溶液混合孵育，固液分离取固相，将所得固相重悬于缓冲液中，并加入细胞穿膜肽继续孵育，固液分离取固相，得到所述拉曼-荧光双模式的纳米探针。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化后的锚定链溶液通过以下方法制备得到：向锚定链溶液中加入硫醇类还原剂进行反应，得到所述活化后的锚定链溶液。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述经表面配体稳定后的纳米金三角片通过以下方法制备得到：将纳米金三角片与表面配体孵育，固液分离取固相，得到所述经表面配体稳定后的纳米金三角片。8.如权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针在定量或定性检测bax mrna中的应用。9.一种非诊断非治疗为目的的bax mrna的检测方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针与待测细胞于培养基中共培养，后加入含有毒素的基本培养基共培养，之后将培养结束的细胞染色和固定，检测拉曼信号值或荧光信号值，得到细胞内bax mrna的检测结果；或将权利要求1所述的拉曼-荧光双模式纳米探针与含bax mrna的溶液混合反应，离心后检测拉曼信号值或荧光信号值，得到体外bax mrna的检测结果。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述细胞选自人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg2、人正常肝细胞qsg-7701和人结直肠腺癌细胞caco-2中的一种或多种。
技术总结本发明提供了一种用于Bax mRNA检测的拉曼-荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用。本发明的拉曼-荧光双模式纳米探针包括纳米金三角片、识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(SH-mPEG)、细胞穿膜肽(TAT)，所述识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(SH-mPEG)、细胞穿膜肽(TAT)包裹在纳米金三角片表面；本发明结合了拉曼和荧光的双重优点，纳米探针可更直观地反映和监测Bax mRNA浓度增加的过程，从而实现细胞凋亡过程中Bax mRNA变化的实时监测，制备简单，性质稳定，生物相容性高。生物相容性高。生物相容性高。
技术研发人员：马小媛 林茜池 徐珊 李晨彪 王周平
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
