本发明涉及单细胞测序领域，尤其涉及基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法。
背景技术：
1、单细胞转录测序技术能够提供单细胞中单核苷酸分辨率的转录本信息，该技术已经成为表征真核细胞多样性的流行工具，极大地提高了对细胞类型和细胞状态的转录异质性的认识。在应用于微生物细胞时，由于微生物细胞尺寸小，具有易发生团聚、细胞分离困难的问题。同时，微生物多样性的细胞壁以及mrna(messenger ribonucleic acid，信使脱氧核糖核酸)缺乏多聚腺苷酸化尾等多种因素都对单细胞转录测序技术的应用造成了极大的阻碍。
2、近期开发的一些细菌高通量单细胞rna测序方法，包括microsplit(microbialsplit-pool ligation transcriptomics,微生物分裂池连接转录组),petri-seq(prokaryotic expression profiling by tagging rnain situ and sequencing用于原核生物单细胞rna测序的高通量技术)、bacdrop(基于液滴的全基因组并行的大规模细菌单细胞rna测序技术)以及smrandom-seq(基于液滴微流控技术的高通量单微生物rna测序分析)方法，克服微生物自身局限性的同时，也极大的提高了测序通量，为微生物在单细胞rna(ribonucleic acid核糖核酸)测序的应用提供了平台。但是由于这些技术流程中多次使用离心操作，导致微生物个体极易损失，对测试样本有较高要求，为了弥补个体损失所带来的误差，至少需要千万级别以上的样本起始量。同时，由于微生物组样本中，微生物种类繁多，不同种类微生物的体积在物种水平存在差异，所以离心后样本中各种微生物的损失程度不同，导致最终结果中往往存在严重的偏差。同时，针对一些珍贵的微生物组样本，由于样本中的微生物数量本就相对较少，离心带来的必然损失使得这类样本无法适用于高通量的单细菌rna测序技术。
3、综上，现有技术中的高通量单细胞测序方法，对测试样本具有极高的要求，还同时具有离心损失严重，且离心损失差距大的问题，导致测序结果具有严重偏差。
技术实现思路
1、本发明提供了基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，以小于10万个微生物数量即可实现测序流程，为较少微生物数量的样本提供了高通量单细胞测序的可能，能够解决因微生物样本损失造成的结果偏差，解决了微生物单细胞测序技术中微生物损失的问题。
2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，包括：
4、将微生物样本固定，固定后的微生物样本制备为水凝胶微球，在微球内部对微生物细胞的rna进行cdna合成，并对cdna进行标记，对标记后的cdna进行建库和测序，得到微生物单细胞的转录组信息。
5、其中，所述微球为多孔网络状结构，表面的孔洞能通过蛋白、试剂，阻拦微球内的微生物个体。
6、进一步的，所述测序方法具体包括以下步骤：
7、将测试的微生物样本制备成单细胞悬液，与固定剂均匀混合，得到固定的微生物样本；
8、将固定后的微生物样本和水凝胶材料混合，得到含有微生物样本的水凝胶溶液；
9、将含有微生物样本的水凝胶溶液制备为油包水液滴，再将液滴中的水凝胶材料凝固；
10、将油包水滴液破乳，清洗后得到包裹微生物样本的微球；
11、对微球中的微生物样本的细胞壁进行消化裂解，使得试剂能通过细胞壁，进入微生物样本的细胞内部；
12、将反转录引物在微生物细胞的rna上进行原位反转录反应合成cdna第一条链，再对cdna进行标记；
13、溶解微球，对从微球中释放的cdna进行纯化，对纯化后的cdna进行建库和测序，得到微生物单细胞的转录组信息。
14、进一步的，固定剂是单纯固定液或混合固定液。
15、单纯固定液包括多聚甲醛、甲醛、福尔马林、甲醇、丙酮、乙醇、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和升汞中的一种。
16、混合固定液包括醋酸-酒精混合液、福尔马林-醋酸-酒精液和包因氏固定液中的多种。
17、进一步的，水凝胶微球在凝固后可以溶解。
18、进一步的，水凝胶微球采用的材料包含琼脂糖、壳聚糖、明胶、透明质酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚n-异丙基丙烯酰胺、海藻酸盐、卡拉胶、聚丙烯酸。
19、进一步的，所述水凝胶溶液的制备方法为：
20、将7.5ul质量浓度40％的丙烯酰胺溶液、2.5μl质量浓度5％的n,n'-双(丙烯酰)胱胺溶液、2.5μl质量浓度10％的过硫酸铵溶液、15ul的pbs(phosphate buffered saline磷酸盐缓冲液)混合后补超纯水到50ul。
21、利用该方法制备水凝胶溶液所得到的微球，具有良好的通透性。
22、进一步的，每个微球中没有或只有一个微生物。
23、进一步的，油包水液滴的制备方法包括：
24、微流控法，将载有不相容液体通过微流道连接，在交汇处产生液滴，然后将液滴交联形成水凝胶微球；
25、乳液法，即通过在表面活性剂的作用下使用两种不相溶的溶剂形成均匀的乳液，并从乳液中沉淀出固体相，使得成核、生长、聚集等过程被限制在小的球形液滴中；
26、批量乳化法，即将不相容的液体混合在一起生成可交联的水凝胶液滴；
27、3d打印法；
28、光刻法，即将光聚焦在掩模版或者模具上固化交联形成水凝胶微球；
29、电喷法，即在针头和接收液之间加上电压，使施加的电压克服针尖处的表面张力，形成了带电的液滴射流，在接收液中交联形成水凝胶微球。
30、进一步的，cdna标记的方法包括：
31、采用带有条形码的反转录引物对所述微生物样本内所有rna进行捕获，在rna上原位反转录合成cdna的第一条链，同时添加第一轮标记，然后再添加一到多次的标记。
32、添加一次标记的方法是：
33、通过末端转移酶将poly(da)(polydeoxyadenosine多聚脱氧腺苷酸)尾巴原位添加到cdna的3’端，随后使用带有条形码的引物完成再一次标记，同时进行cdna第二链合成。
34、添加多次标记的方法是：
35、再进行两轮条形码标记，通过连接酶，后面两轮条形码都会连接到第一轮条形码后面，最后纯化cdna后进行第二链合成。
36、进一步的，对cdna标记的方法包括：
37、用poly(a)(polyadenosine多聚腺苷酸)聚合酶i对rna(ribonucleic acid核糖核酸)进行原位多聚腺苷酸化，使用带有条形码标记的随机六聚体引物和带有条形码标记的poly(dt)(多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸)引物对微生物进行第一轮标记和反转录反应合成cdna第一条链，再通过连接酶进行第二轮、第三轮条形码的标记，最后纯化cdna后进行cdna第二链合成。
38、本发明的有益效果是：
39、本发明能够适以较少起始量(最低能以5万起始量测出数千个细菌的信息)微生物样本进行的高通量单细菌分析，解决了微生物单细胞测序技术中微生物损失的问题,有效降低了所需微生物起始量，避免了多次离心造成的微生物个体粘连。又因为在合成cdna时同时进行编码操作，使得cdna能够适用于包括基于微流控等的多种高通量微生物单细胞测序技术，对于一些数量少的珍贵微生物组样本，也可使用本发明的方法进行高通量的测序。
40、本发明将单个微生物包裹到真核细胞大小相当的水凝胶微球中，不同微球个体大小均一，可以在2000g，1min的离心条件下迅速沉淀，无需依据不同菌种进一步离心。不同微生物包裹在相同大小的微球中，不会因为体型重量的差异而出现不同的沉淀速度，有限避免了离心过程中出现损失率差异。
41、本发明中包裹微生物的微球为多孔网络状结构，允许蛋白、各种试剂穿过，但是却不足以让微生物个体穿过，能够对包裹在微球中的微生物直接进行rna捕获和接头添加，防止高速离心导致的微生物结团，减少离心导致的微生物丢失。微球采用可逆材料制作，凝固后仍然可以溶解释放其中的细菌，方便后续实验操作。
1.基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述测序方法具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述固定剂是单纯固定液或混合固定液；
4.根据权利要求1所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述水凝胶微球在凝固后可以溶解。
5.根据权利要求4所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述水凝胶微球采用的材料包括琼脂糖、壳聚糖、明胶、透明质酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚n-异丙基丙烯酰胺、海藻酸盐、卡拉胶、聚丙烯酸。
6.根据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述水凝胶溶液的制备方法为：
7.根据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，每个所述微球中没有或只有一个微生物。
8.根据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述油包水液滴的制备方法包括：
9.据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，对所述cdna标记的方法包括：
10.根据权利要求2所述的基于水凝胶微球的微生物单细胞转录组测序方法，其特征在于，对所述cdna标记的方法包括：
