本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于荧光淬灭技术的碱性蛋白酶活性检测方法。
背景技术：
1、蛋白酶是指能够将蛋白质降解成小肽和氨基酸的水解酶，占整个工业酶市场的60％，碱性蛋白酶是在中性至碱性ph范围内具有活性的蛋白酶的统称。微生物碱性蛋白酶在洗涤剂、食品加工、皮革制造、纺织制造等工业中被广泛应用和研究。目前，我国碱性蛋白酶研究已经达到了分子水平，利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造碱性蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势。
2、在碱性蛋白酶的改造过程中，对其酶活力的测定是检验改造结果的必要环节，目前检测蛋白酶酶活力的方法主要是国标法，其原理是，蛋白酶水解酪蛋白产生的酪氨酸上的酚基能够在碱性环境下，同福林酚反应产生蓝色沉淀，这种蓝色沉淀在od680有吸收峰，实际上是测定蛋白酶水解底物中酪氨酸形成肽键的能力，国标法测定酶活时，所需时间长且步骤较为复杂。
3、本发明利用荧光共振能量转移原理测定碱性蛋白酶的酶活，共振能量转移理论早在1948年就已经被提出，荧光共振能量转移具有分析速度快、方法灵敏度高、选择性好、无污染或污染小等优点。fret的荧光材料多种多样，包括量子点、碳点、荧光蛋白、有机染料和上转换纳米粒子等。近年来，研究人员对于荧光共振能量转移技术的研究从早期的两个荧光基团之间，逐渐扩展到纳米材料与荧光基团之间，目前，荧光共振能量转移技术已经广泛应用于生物学中生物分子的结构和动力学研究，如核酸分析、免疫分析、蛋白质分析、糖类分析等。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种基于荧光淬灭技术的碱性蛋白酶的活性检测方法。
2、发明提供的方法，包括如下步骤：
3、(1)制备待测样品、荧光底物及缓冲液。
4、(2)在避光96孔板中加入缓冲液及荧光底物，封闭孔板预热，随后加入待测样品进行反应，测定其荧光强度；对照组以缓冲液替代待测样品。
5、(3)检测反应体系在510nm处的荧光强度，根据荧光强度的强弱比较待测样品中的碱性蛋白酶活力。
6、本发明中利用荧光底物测定蛋白酶活力，酶活定义如下：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度和ph值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
7、上述方法中，所述荧光底物序列以dabcyl-ktxxv↓l↓qxxf↓rxm↓e-edans为模版构建，具体序列为dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans。该序列的猝灭基团为dabcyl、荧光基团为edans。所述反应条件为：40℃预热2min后，40℃反应10min。所述检测条件为510nm。
8、本发明的实验证明，本发明发现了一种基于荧光淬灭技术的碱性蛋白酶的活性检测方法，该方法具有快速、简单、灵敏等优点。进一步的，本发明可以测定碱性蛋白酶发酵液的酶活，用于筛选高产碱性蛋白酶的菌株。
9、本发明的有益效果：
10、本发明基于荧光共振能量转移原理设计碱性蛋白酶的活性检测方法，过程操作简单，耗时短，样品需求量小，并且可以同时进行多个样品的酶活测定工作，能够满足大批量样品测定工作的需求，适用于高通量的应用。
1.一种基于荧光淬灭技术的碱性蛋白酶的活性检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光底物的特定模版序列如下：dabcyl-ktxxv↓l↓qxxf↓rxm↓e-edans。其中c端edans是一种荧光基团，n端基团dabcyl是一种荧光淬灭剂，酶切位点为v↓l、l↓q、f↓r和m↓e，x可替换为不同的氨基酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将所述模版序列中的x根据多肽性质替换为不同的氨基酸，经分子模拟筛选得到荧光底物序列：dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的缓冲液与待测样品及荧光底物的体积比为：8:1:1。所述缓冲液为50mm，ph为7.5的hepes溶液。所述反应的条件为：40℃，10min。
