本发明属于蛋白质定量检测，具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒及荧光定量检测方法。
背景技术：
1、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，ngal)又名人中性粒细胞载脂蛋白(human neutrophil 1ipocalin，hnl)，是一种糖蛋白，参与细胞增殖、肿瘤、肾损伤、急性感染等生理病理过程。对ngal进行准确定量，有助于ngal的实验室研究和临床应用。蛋白印迹(mishra j，et a1.2004,am jnephrol，24(3)：307-315)、放射免疫分析(xu s y，et al.1994.j immunol methods，171(2)：245-252)、酶联免疫吸附试验(krzeminska e，et al.2016，j clin lab ana1，30(6)：956-960，cai，l，2009.clinica chimicaacta，403(1-2)：121-125)、化学发光免疫分析技术(hawksworthd，etal.2012.hybridoma(larchmt)，31(6)：436-442)、颗粒增强比浊免疫分析技术(hansen yb，et al.2014.scand j clin lab invest，74(1)：20-26)等ngal定量方法存在操作复杂、检测耗时长、线性范围窄、对设备要求高等不足。因此，需要一种检测步骤简单，检测耗时少，线性范围宽、制备成本低的ngal定量检测产品和方法，实现ngal快速定量。
技术实现思路
1、本发明的主要目的在于提供一种非临床诊断用的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒及荧光定量检测方法，以克服现有技术的不足。
2、为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
3、本发明提供了一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其包括ngal荧光传感器、报告分子、ngal标准品；其中，ngal分子能与所述报告分子竞争结合ngal荧光传感器；所述ngal荧光传感器包括具有g-四联体结构(g-quadruplex)和ngal核酸适配体结构的核苷酸链；所述报告分子为能与g-四联体结构特异性结合并产生荧光信号的荧光染料分子或荧光染料分子标记的物质。
4、本发明还提供了前述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒在制备荧光检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的产品中的用途。
5、本发明还提供了一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的荧光定量检测方法，其包括：
6、采用稀释液对ngal标准品进行梯度稀释，获得ngal标准品梯度工作液；
7、采用稀释液对待检测样品进行稀释，获得样品测试液；
8、对ngal荧光传感器进行活化处理，之后与报告分子、样品测试液、ngal标准品梯度工作液混合进行孵育，然后进行荧光检测获得样品测试液和ngal标准品梯度工作液的荧光信号强度；
9、根据ngal标准品梯度工作液中ngal浓度和对应的荧光信号强度，建立ngal浓度与荧光信号强度的标准工作曲线；
10、根据样品测试液荧光强度与前述标准工作曲线，从而实现中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的荧光定量检测。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
12、(1)本发明中的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的检测试剂盒用于荧光定量检测ngal时，检测耗时少，可在10min内实现ngal定量；
13、(2)本发明中的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的检测试剂盒用于荧光定量检测ngal的灵敏度高、检测线性范围宽，其线性范围为1～1000μg/l；
14、(3)本发明的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的检测试剂盒中的ngal生物传感器为体外人工合成，可规模化生产，且无需生物素、荧光素等分子的修饰，制备简单、生产成本低、批间差异小、性质均一稳定、可常温保存；
15、(4)本发明的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的检测试剂盒中的ngal生物传感器中的核酸适配体序列具有特异性识别ngal的特性，这可保证检测的特异性；
16、(5)本发明的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的检测试剂盒及荧光定量检测方法的反应体系简单，步骤少且易操作，对测试人员的技术要求低。
1.一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括ngal荧光传感器、报告分子、ngal标准品；
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述ngal荧光传感器的核苷酸链序列包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10中的任意一种，优选seq id no.1。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料分子包括硫黄素t、n-甲基吗啉、4-(2-氨基乙氧基)-n2,n6-二[4-(2-氨基乙氧基)-2-喹啉基]-2,6-吡啶二甲酰胺、三苯甲醇-4,4',4"-三羧酸、bmvc、cy5或cy7中的任意一种；所述荧光染料分子标记的物质包括荧光染料分子修饰的berberine、chelerythrine、g-四联体识别肽、g-四联体结合蛋白或g-四联体核酸适配体中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于ngal标准品和待检测样品稀释的稀释液，所述稀释液包括hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液；所述待检测样品包括血清、血浆、尿液、泪液、唾液、脑脊液、肺洗液、组织匀浆液中的任意一种生物样品。
5.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述ngal荧光传感器与报告分子在试剂盒中独立存在；或者，所述ngal荧光传感器与报告分子预先混合，以混合物在试剂盒中存在。
6.权利要求1-5中任一项所述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白检测试剂盒在制备荧光检测中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的产品中的用途。
7.一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的荧光定量检测方法，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述ngal标准品的梯度工作液的浓度为1～1000μg/l。
9.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述活化处理包括热处理方法活化、阳离子处理方法活化、超声处理方法活化中的任意一种，优选热处理方法活化，其中，所述热处理方法活化的条件包括：将tris盐酸缓冲液与ngal荧光传感器混合并于95℃c加热5～10min。
10.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，具体包括：将ngal荧光传感器与报告分子混合并孵育后，再与ngal标准品的梯度工作液或样品测试液混合并孵育5～20min后进行荧光信号检测；或者，将ngal荧光传感器与ngal标准品的梯度工作液或样品测试液混合并孵育不少于5min后，再与报告分子混合并孵育1～20min后进行荧光信号检测。
