本发明属于生物检测，具体涉及mofs-纳米孔道复合探针、制备及液体中微量甲烷的检测方法。
背景技术：
1、细胞代谢是指细胞内一系列的化学反应过程，包括物质合成、分解、转化和能量转换等，这些反应过程与生物体的生理活动和病理过程密切相关。例如，在肿瘤细胞中，由于代谢通路的改变和基因表达的异常，会导致一系列代谢产物的异常积累和消耗，从而导致细胞内活性氧(ros)、谷胱甘肽和过氧化氢等物质的浓度异常增加。有研究证明，甲烷可以由所有代谢活跃的细胞通过一种非酶促过程产生，从而达到抗氧化应激的目的。甲烷作为生物体内ros水平的间接标志物，通过检测其浓度可反映细胞代谢水平。同时，通过对细胞中甲烷浓度的研究，可以更好理解甲烷在这些生理和病理过程中的产生机理和相关作用，为将甲烷作为细胞代谢研究新靶点提供理论依据和实验支撑，有助于发现并治疗相关的疾病。
2、目前常见的甲烷测量方法包括红外甲烷传感器、电阻传感器、光谱传感器等。这些检测方法能够在气体体系中反映甲烷浓度，但针对液体体系中低含量甲烷的精准测量仍然存在挑战。因此，发展液体体系中，尤其是生物体内甲烷气体的检测方法具有重要意义。
3、纳米孔道技术通过记录在电场驱动下单个待测物穿过孔道引起的电流变化，能够准确测量待测物的本征信息，是一种逐渐受到关注的单分子测量方法。随着研究需求的不断扩大和制备技术的不断发展，目前主要的纳米孔道分为生物纳米孔道、固体纳米孔道两大类。锥形纳米孔道是一种特殊的固体纳米孔道，通过对商品化石英或硼硅酸盐毛细管加热拉制而成。其优势之一是根据研究对象的尺寸不同，可以制备孔径尺寸在10nm至1μm之间的纳米孔道，实现多尺度测量。锥形纳米孔道的另一优势在于在实际应用过程中，可以通过对其内壁电镀金属镀层或在尖端进行化学修饰等策略，调控纳米孔的特异性响应，实现纳米孔道的功能化，将其应用于各种分析检测。
4、多孔、大比表面积的金属有机框架(mofs)是修饰纳米孔道的一种重要材料，可以用于测量过氧化氢浓度、构建钠、钾离子选择性通道等方面的研究。具有大比表面积和高孔隙率mofs材料具备吸附和识别甲烷分子的特性，美国西北大学omar k.farha课题组和美国国家标准与技术研究院(nust)的taner yildirim合作，在jacs杂志上发表文章，探究了六种mof材料(hkust-1、pcn-14、utsa-20、nu-111、nu-125和ni-mof-74)的比表面积、孔容、密度等性质对甲烷吸附量的影响，然而，现有的研究工作仅能利用mofs材料检测或分离气体体系内的甲烷，无法实现液体体系中甲烷分子的定量检出，因而亟需开发一种液体体系中低浓度甲烷的高灵敏度定量检测手段。
技术实现思路
1、为了克服上述现有甲烷检测方法的不足，本发明的目的在于提供一种mofs-纳米孔道复合探针、制备及液体中微量甲烷的检测方法，基于多孔金属有机框架的甲烷吸附特性，与玻璃纳米孔道特有的空间限域特性，通过简单的电化学分析方法，实现液体中甲烷的快速动态检测，具有简单、快速、高灵敏、高分辨检测液体内甲烷的特点。
2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
3、mofs-纳米孔道复合探针，包括探针本体1，在探针本体1内设置有锥形的纳米孔道2，纳米孔道2内壁尖端0.5―1cm处生长有金属有机框架晶体3，纳米孔道2内还填充有电解质溶液4。
4、mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，包括以下步骤：
5、1、制备具有锥形的纳米孔道的探针本体；
6、2、将金属离子溶液和配体溶液混合均匀形成混合溶液，注入锥形的纳米孔道内静置，使金属有机框架晶体生长在纳米孔道内壁尖端0.5―1cm处，形成金属有机框架-纳米孔道电化学复合气体检测探针；
7、3、再向纳米孔道内注入电解质溶液，得到最终所需的mofs-纳米孔道复合探针。
8、步骤1具体为：将玻璃毛细管拉制成具有锥形的纳米孔道的探针本体，纳米孔道尖端直径在10nm―10μm之间。
9、步骤2具体为：金属离子溶液和配体溶液按照目标mofs的成核浓度，来确定各自的溶液摩尔浓度再按照体积比1:1混合均匀，形成混合溶液；将混合溶液用气相尖头微量进样器吸取微量混合溶液注入步骤1获得的纳米孔内0.5―1cm，在显微镜下观察到纳米孔内溶液无气泡后，静置使金属有机框架晶体生长纳米孔道尖端内壁上，备用。
10、所述的金属离子溶液包括浓度为50mm―500mm的硝酸铜溶液、醋酸铜溶液或硝酸镍溶液；
11、所述的配体溶液包括浓度为50mm―500mm的均苯三甲酸溶液或2,5-二羟基对苯二甲酸溶液。
12、进一步，所述的溶液混合溶液为50mm―500mm硝酸铜和50mm―500mm均苯三甲酸的等体积混合，或50mm―500mm硝酸镍和50mm―500mm2,5-二羟基对苯二甲酸的等体积混合。
13、所述步骤(3)的电解质溶液包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。
14、mofs-纳米孔道复合探针在液体中微量甲烷的检测方法，具体步骤如下：
15、a、检测时，使用扫描电化学显微镜作为测量平台，采用两电极体系检测，两根ag/agcl电极被用来连通电路，一根ag/agcl电极插入mofs-纳米孔道复合探针的纳米孔中，作为工作电极，另一根ag/agcl电极置于基底溶液中，作为参比/对电极，电压记录范围为-0.5v—+0.5v；
16、b、将mofs-纳米孔道复合探针的尖端浸没到以生理盐水作为基底的基底溶液中，按照步骤a的连通电路进行检测，检测此时的电流—电压曲线作为空白组；
17、c、将生理盐水替换成含甲烷的待测的基底溶液，通过离子电流曲线记录mofs-纳米孔道复合探针尖端离子通量的变化，从而实现对溶液体系中低浓度甲烷的检测。
18、步骤c具体为：将复合探针的尖端浸没到待测的基底溶液中，基底溶液中的甲烷分子被物理吸附在mofs-纳米孔道复合探针的纳米孔道尖端处金属有机框架表面的孔隙中，使纳米孔道尖端的孔隙变小，离子通量减小，电流—电压曲线改变，在测定过程中，扫描电化学显微镜直接在电脑屏幕上自动绘制出电流—电压曲线，测定结束后，对比空白组与待测组曲线对数据进行分析，从而实现对溶液体系中低浓度甲烷的检测。
19、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
20、(1)本发明首次提出金属有机框架对甲烷的吸附作用，结合玻璃纳米孔道尖端限域的特性，利用多孔金属有机框架物理吸附甲烷分子的原理，使溶液中的微量甲烷吸附在金属有机框架表面孔隙，带来纳米孔尖端孔隙体积的改变，进一步改变离子通量，从而实现甲烷的定量传感分析；本发明的复合探针基于纳米孔道的空间限域特性，对目标分子能够实现低浓度识别，放大检测信号，从而实现甲烷的定量传感分析检测。
21、(2)本发明复合探针的制备过程容易重复再现，工艺流程简单，制备的功能化的玻璃纳米孔，在模拟细胞环境的生理盐水体系表现出优异的上述性能，提供了高效的检测方法，在生物传感、疾病诊疗等领域有广阔的应用前景；
22、综上所述，本发明使用新颖的玻璃纳米孔检测方式，玻璃纳米孔是纳米级材料，对细胞的刺激较小，在玻璃纳米孔内壁修饰金属有机框架，检测时受待测体系的干扰成分影响小，无需复杂的前期样品准备，通过简单的电化学分析方法，实现液体中甲烷的快速动态检测，具有简单、快速、高灵敏、高分辨检测液体内甲烷的特点。
1.mofs-纳米孔道复合探针，包括探针本体(1)，其特征在于，在探针本体(1)内设置有锥形的纳米孔道(2)，纳米孔道(2)内壁尖端0.5―1cm处生长有金属有机框架晶体(3)，纳米孔道2内还填充有电解质溶液(4)。
2.mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，步骤1具体为：将玻璃毛细管拉制成具有锥形的纳米孔道的探针本体，纳米孔道尖端直径在10nm―10μm之间。
4.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：金属离子溶液和配体溶液按照目标mofs的成核浓度，来确定各自的溶液摩尔浓度再按照体积比1:1混合均匀，形成混合溶液；将混合溶液用气相尖头微量进样器吸取微量混合溶液注入步骤1获得的纳米孔内0.5―1cm，在显微镜下观察到纳米孔内溶液无气泡后，静置使金属有机框架晶体生长纳米孔道尖端内壁上，备用。
5.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，所述的金属离子溶液包括浓度为50mm―500mm的硝酸铜溶液、醋酸铜溶液或硝酸镍溶液。
6.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，所述的配体溶液包括浓度为50mm―500mm的均苯三甲酸溶液或2,5-二羟基对苯二甲酸溶液。
7.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，所述的溶液混合溶液为50mm―500mm硝酸铜和50mm―500mm均苯三甲酸的等体积混合，或50mm―500mm硝酸镍和50mm―500mm2,5-二羟基对苯二甲酸的等体积混合。
8.根据权利要求2所述的mofs-纳米孔道复合探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3的电解质溶液包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。
9.根据权利要求1或2所述的mofs-纳米孔道复合探针在液体中微量甲烷的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
10.根据权利要求9所述的mofs-纳米孔道复合探针在液体中微量甲烷的检测方法，其特征在于，步骤c具体为：将复合探针的尖端浸没到待测的基底溶液中，基底溶液中的甲烷分子被物理吸附在mofs-纳米孔道复合探针的纳米孔道尖端处金属有机框架表面的孔隙中，使纳米孔道尖端的孔隙变小，离子通量减小，电流—电压曲线改变，在测定过程中，扫描电化学显微镜直接在电脑屏幕上自动绘制出电流—电压曲线，测定结束后，对比空白组与待测组曲线对数据进行分析，从而实现对溶液体系中低浓度甲烷的检测。
