本发明涉及合成生物学，具体而言，涉及一种重组表达载体、重组细胞及其应用和外源活性物质生物合成方法。
背景技术：
1、圆红冬孢酵母(rhodotorula toruloides)是一种能够天然合成多种类胡萝卜素和油脂的非模式酵母，能够天然合成类胡萝卜素、油脂、苯丙氨酸解氨酶和d-氨基酸氧化酶等重要化合物，能够累积超过自身细胞干重70％的油脂。该菌株具有高密度发酵的特性，能够耐受较低ph值、高渗透胁迫、氧化胁迫等，特别是该酵母能够高效利用各种木质纤维素水解液作碳源，对水解液副产物具有很强的耐受和代谢能力。圆红冬孢酵母已经被报道被用于微生物油脂、萜烯类化合物、各种高价值酶、糖醇和聚酮化合物的生产研究，拥有广阔的工业应用前景。
2、目前，圆红冬孢酵母的遗传编辑和代谢工程改造工具尚不完善，还不能像解脂耶氏酵母或酿酒酵母等模式生物那样进行精确的基因编辑和多轮迭代整合，阻碍了其在合成生物学方面的进展，其天然的代谢特性也未被充分开发利用，在生产高价值天然产物方面仍有很大提升空间。想要在该酵母中进行便捷的遗传操作，需要开发更加高效的基因表达平台。
3、golden gate克隆技术依赖于type iis限制性内切酶，最早发现于1996年。iis型限制性内切酶与“传统”限制性内切酶的不同之处在于，iis型限制性内切酶在识别序列之外切割，形成4个碱基的粘性末端。由于这些粘性末端不是识别序列的一部分，因此可以定制它们来直接组装dna片段。这种技术可以精确地将目标基因片段插入到载体中，或者将多个基因片段组合在一起，形成复杂的基因结构。在合成生物学领域，golden gate克隆技术可以用于构建复杂的基因网络和代谢途径。通过连接多个基因片段，可以创建具有特定功能的合成生物学系统，该技术已被广泛运用于解脂耶氏酵母、酿酒酵母等模式生物中用于研究生物过程、生产有用的生物产品，但在圆红冬孢酵中未见报道。
4、神经酸(c24:1)，是一种含有24个碳原子的超长链单不饱和脂肪酸，是神经细胞膜的重要组成成分，可以促进神经系统的发育，对各种脱髓鞘疾病有治疗作用，还可用于增强机体免疫功能、抗癌、抗艾滋等。神经酸可以从动物、植物、微生物中提取，或者通过化学合成获得。我国目前主要是通过从元宝枫、文冠果、蒜头果等植物中提取获得，但因这些木本植物分布狭窄、产量低、周期长等原因，神经酸仍然稀缺，价格高昂。
5、伴随着合成生物学的发展，转基因工程酵母成为了新兴的可能的神经酸来源之一，有可能可以补充甚至替代传统的植物神经酸来源。圆红冬孢酵母因其特殊的脂肪酸组成、代谢特性及其鲁棒性，是一种有潜力的底盘菌株，可以用于开发生产包括但不限于神经酸等各类化合物。但因其缺乏有效的基因编辑工具和合成生物学平台，对圆红冬孢酵母的遗传操作及利用研究仍然较少，因此迫切需要开发快速、高效、标准化、模块化的合成生物学平台，以促进圆红冬孢酵母在神经酸等外源活性物质生产领域的应用。
6、鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种重组表达载体、重组细胞及其应用和外源活性物质生物合成方法以简化并加速多基因在圆红冬孢酵母中的整合与表达过程，从而建立一个高效、灵活、标准化、模块化的合成生物学平台，促进圆红冬孢酵母合成生物学领域的发展，推动圆红冬孢酵母在生物制造、生物能源及生物医药等领域的广泛应用。此外，本发明提供的重组表达载体可用于神经酸等多种外源活性物质的生物合成，具有广谱的应用价值。
2、本发明是这样实现的：
3、第一方面，本发明提供了一种重组表达载体，重组表达载体包括基础载体，以及在基础载体上的如下元件：启动子、外源基因、终止子和筛选标记基因；启动子是圆红冬孢酵母中内源的组成型启动子；
4、基础载体还包括pzpk骨架、细菌筛选标记表达盒和真菌筛选标记表达盒；外源基因至少为2个。
5、第二方面，本发明提供了一种重组细胞或重组菌，其包括上述的重组表达载体。
6、第三方面，本发明还提供了一种能生物合成外源活性物质的底盘圆红冬孢酵母细胞，其包括上述的重组表达载体。
7、第四方面，本发明还提供了重组表达载体、重组细胞或重组菌或底盘圆红冬孢酵母细胞在外源活性物质合成中的应用。
8、第五方面，本发明还提供了一种外源活性物质的生物合成方法，其包括如下(1)-(2)中任一项的方法：
9、(1)将重组表达载体转化宿主细胞，进行细胞培养；
10、(2)培养重组细胞或重组菌或底盘圆红冬孢酵母细胞；
11、优选地，所述方法(1)中，先将重组表达载体转化农杆菌；然后将农杆菌转化圆红冬孢酵母；
12、优选地，先将重组表达载体转化大肠杆菌，选择测序正确的重组表达载体转化农杆菌；然后将农杆菌转化圆红冬孢酵母。
13、本发明具有以下有益效果：
14、本发明开发了一种新的遗传转化操作工具(命名为rtgga assembly platform)，该平台或重组表达载体包括启动子、终止子、筛选标记基因和基础载体；可以一次性实现多个基因的随机整合和表达，可进行多轮的基因表达整合。rtgga assembly platform的建立，简化了多基因在圆红冬孢酵母中的整合与表达过程，建立了一个高效、灵活、标准化、模块化的圆红冬孢酵母合成生物学平台。
15、本发明的提出，有望促进圆红冬孢酵母合成生物学领域的发展，推动圆红冬孢酵母在生物制造、生物能源及生物医药等领域的广泛应用。
16、此外，本发明提供的重组表达载体可用于神经酸等多种外源活性物质的生物合成，具有广谱的应用价值。本发明提供的外源活性物质的生物合成方法简单易行，方便工业化生产。
1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括基础载体，以及在基础载体上的如下元件：启动子、外源基因、终止子和筛选标记基因；所述启动子是圆红冬孢酵母中内源的组成型启动子；
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述圆红冬孢酵母中内源的组成型启动子选自葡萄糖6-磷酸异构酶启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、果糖1,6-二磷酸醛缩酶启动子、甘油醛磷酸脱氢酶启动子、翻译延伸因子启动子和巴斯德毕赤酵母烯醇酶1的启动子、磷酸三糖异构酶、核糖体亚基蛋白质、醇氧化酶启动子或具有修饰特征的变体、甲醛脱氢酶启动子、异柠檬酸裂解酶启动子、α-酮异己酸脱羧酶启动子、热休克蛋白质家族成员启动子、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶启动子、磷酸甘油酸突变酶启动子、转酮醇酶启动子和磷脂酰肌醇合成酶启动子中的至少一种；
3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述外源基因选自用于表达外源肽或外源蛋白质的基因；
4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，筛选标记基因选自博来霉素、遗传霉素、潮霉素、诺尔斯菌素、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶基因(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶基因(hprt)、胸腺嘧啶激酶基因(tk)、嘌呤霉素乙酰转移酶基因(puro)、营养缺陷型标记基因中的至少一种；
5.一种重组细胞或重组菌，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组细胞或重组菌，其特征在于，所述重组细胞或重组菌为细菌或真菌；
7.一种能生物合成外源活性物质的底盘圆红冬孢酵母细胞，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的重组表达载体；
8.如权利要求1-4任一项所述的重组表达载体、权利要求5-6任一项所述的重组细胞或重组菌或权利要求7所述的底盘圆红冬孢酵母细胞在外源活性物质合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述外源活性物质选自脂肪酸、外源萜类化合物、糖醇化合物和聚酮化合物。
10.一种外源活性物质的生物合成方法，其特征在于，其包括如下(1)-(2)中任一项所述的步骤：
