本发明属于生物医学以及光学，本发明涉及一种面向术中切缘评估的生物分子指纹提取方法及系统，特别是涉及一种大视场近红外自体荧光功能成像引导下的拉曼光谱采集方法和系统。
背景技术：
1、局部切除手术治疗早期肿瘤(如乳腺原位导管癌)不仅可以获得与全部切除手术相当的病人术后存活率，而且可以显著缩短病人术后恢复时间，并降低其手术成本，大大改善病人术后生活质量。局部切除手术时，外科医生切除肿瘤组织以及周围的少量健康组织，以确保所有肿瘤组织被切除，并尽可能少的切除健康组织，以最大限度的减少正常组织切除带来的功能缺失：即外科医生需要进行术中切缘评估。
2、目前，外科医生主要利用术前影像(如ct、mri和超声成像)规划手术路径，或采用术中冷冻切片、细胞学印片以确定切除生物组织病理类型。然而，实际手术操作(如乳腺癌保乳手术时的乳房皮肤切除)不可避免的导致实际手术时生物组织的相对位置关系与术前影像观察的生物组织相对位置关系不同，使得术前影像规划的手术路径不完全适用于实际手术。术中冷冻切片、细胞学印片应用于实际手术切除的生物组织，有效避免了术前影像面临的困难，但是，其耗时较长，显著延长了手术时间。因此，需要解决现有依赖于术前影像、术中冷冻切片和细胞学印片的切缘评估方法面临的实际难题。
3、拉曼光谱技术是一种基于非弹性拉曼散射的光谱技术，其光谱信号源于分子不同的振动模式。因此，拉曼光谱技术可以实现生物组织蛋白质、脂质、dna和水分子等分子指纹探测。肿瘤组织和正常组织的分子指纹不同，为实现基于拉曼光谱技术的术中切缘评估奠定了病理和物理基础。如，已有研究采用拉曼光谱用于乳腺癌保乳手术切缘评估，初步证明了基于拉曼光谱分子指纹探测的术中切缘评估潜力。然而，现有拉曼光谱技术受分辨率、采集时间等限制，其用于术中切缘评估面临如下问题：(1)其主要探测局部点位置的分子指纹，无法有效记录分子指纹探测位置；(2)其速度较慢，无法满足保乳手术中较大体积手术腔的快速术中切缘评估的现实临床需求。
4、近红外自体荧光成像技术具有省时、高空间分辨率的特点，但是近红外自体荧光成像技术的特异性和敏感性较低，不适于术中单独应用。因此，结合拉曼光谱和近红外自体荧光成像的选择性采样拉曼光谱技术十分必要。在近红外自体荧光成像的指导下，可以大大减少对较大面积的乳房组织进行拉曼测量次数，从而节省保乳手术的时间。近年来，对选择性采样拉曼光谱技术的研究不断发展，旨在以最高的可能精度和合理的时间范围(例如，少于30分钟)在术中识别较大的乳腺组织。然而，这些近红外自体荧光成像都是由紫外光激发的，对于外科医生来说，紫外光不如近红外光(785nm)安全。但是由于近红外光的发射光(大于810nm)是肉眼不可见的，因此，组织的近红外自体荧光图像不在外科医生的手术视野中，从而增加了临床翻译时间。覆盖组织成像方法可以解决这个问题，但他们没有考虑乳腺组织拉曼光谱的可视化。而有些考虑组织拉曼光谱可视化的研究，只是将探针的轨迹根据拉曼光谱的类型叠加在成像视频上，并没有呈现在外科医生的手术视野中，而且近红外荧光成像需要提前在组织上施用荧光增强剂(如原卟啉ix)，增加了手术时间。
5、总之，现有针对保乳手术中，早期肿瘤(如乳腺原位导管癌)边缘点评估技术存在的问题如下：
6、1，近红外自体荧光成像依赖于在组织上施用荧光增强剂(如原卟啉ix)，这增加了保乳手术的时间和医生操作的工作量。
7、2，用于切缘评估的光纤式拉曼光谱探针探测深度有限，无法探测深层生物组织拉曼光谱分子指纹；用于切缘评估的光纤拉曼光谱探针探测深度：皮肤是～1cm，并且依赖于组织，无法探测深层生物组织拉曼光谱分子指纹。
8、3，在进行切缘评估时，无法将根据不同组织类型对应不同颜色的探针轨迹坐标点直接呈现在医生手术视野中，而是将探针轨迹叠加在临床成像视频上，增加了医生临床翻译的时间和工作量。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法及系统，在术中切缘评估时，实现无需染色、成像深度大的生物组织荧光成像，并结合投影技术，将荧光图像投影到组织样本上，引导实现深层生物组织拉曼光谱分子指纹探测以及协同实现拉曼光谱轨迹点在生物组织上的投影可视化。
2、为实现上述目的，本发明提供一种面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，所述方法包括如下步骤：
3、s100.切缘的粗分，具体包括：
4、s101.激光笔定位工作面；采用两个激光笔进行定位，使得两个激光点在工作面上相交，用以判断系统工作距离是否在设定距离处；
5、s102.近红外相机和投影仪的位置配准；采用预设配准图案，借助于可见光相机作为配准中间媒介，对近红外相机和投影仪进行图像配准；
6、s103.激光激发组织；在激光的激发下，组织产生近红外自体荧光信号，形成荧光图像；
7、s104.近红外相机采集荧光图像；滤光之后，被近红外相机接收产生组织的近红外荧光对比图像；
8、s105.对荧光对比图像进行裁剪、提高对比度、二值化、去噪、投影仪视场匹配，并绘制荧光区域的边缘；
9、s106.投影仪将步骤s105得到的图像投影到组织表面上，实现异常组织和正常组织的粗分；
10、s200.切缘的细分，具体包括：
11、s201.可见光相机和投影仪的位置配准；采用预设配准图案，对可见光相机和投影仪进行图像配准，求得配准矩阵；
12、s202a.探针采集组织拉曼光谱；在窄带激光下激发组织，探针收集组织产生的拉曼光谱信号，并被光谱仪接收；
13、s202b.与步骤s202a同步，可见光相机在记录整个成像过程的同时，也采集探针扫描异常组织和正常组织切缘轨迹的图像；
14、s203a.对s202a中采集到的拉曼光谱进行分类；
15、s203b.与步骤s203a同步，将探针轨迹扫描的每帧图像经过探针尖端坐标点寻找算法处理之后，得到各探针扫描轨迹坐标点；
16、s204.结合步骤s203a光谱分类结果和步骤s203b得到的各探针扫描轨迹坐标点，对不同的光谱点赋予不同的颜色，从而生成不同组织类型处对应不同颜色点的探针轨迹坐标点图；
17、s205.采用步骤s201得到的配准矩阵，对步骤s204得到的不同颜色探针轨迹扫描坐标点图和投影仪进行视场匹配；
18、s206.将该不同颜色的轨迹坐标点图投影到组织表面上，从而帮助医生精确判断切缘的组织类型。
19、进一步，步骤s101中，采用两个650nm的激光笔进行定位，两个激光点在工作面上相交时，该系统的工作距离是30cm，即近红外相机镜头面到工作面的距离是30cm。
20、进一步，步骤s103中，在785nm激光激发下根据组织自身的特性产生大于810nm的近红外自体荧光信号。
21、进一步，步骤s202a中，采用785nm激光或1064nm激光进行激发。
22、进一步，步骤s202b中，探针尖端坐标点寻找算法流程如下：
23、p1.制作颜色标志物；首先结合探针的几何形状在探针上采用颜色块进行标记；所述颜色块由上方的第一颜色块和下方的第二颜色块组成；
24、p2.帧图像降尺寸；降低输入图像尺寸到原来的二分之一；
25、p3.hsv颜色块分割；在hsv颜色空间中分别保留第一颜色块和第二颜色块对应的特定颜色部分，进行形态学的开、闭运算，对分割图像进行噪声去除之后，则面积最大的两个分割区域即分别为第一颜色块和第二颜色块对应的hsv分割区域；
26、p4.判断是否有遮挡；判断p3中计算出的第二颜色块和第一颜色块图像面积的比值，若小于设定阈值，则判断是存在遮挡的情况，下一步进行p5*，若大于等于该阈值，则不存在遮挡的情况，下面依次进行p5-p6；
27、p5*.删除被遮挡的探针图片和采集到的对应的光谱；
28、p5.角点坐标查找；选取opencv中最小外接矩形算法，得到第一颜色块的4个角点坐标，从而计算出第一颜色块的中心坐标；选取opencv中最小外接三角形算法，得到第二颜色块对应的3个角点坐标；
29、p6.获得探针尖端坐标点；探针的尖端坐标为第二颜色块3个角点坐标中距离第一颜色块中心坐标最远的角点坐标。
30、进一步，步骤s103中，在自体荧光成像部分，采用365nm或405nm激光激发生物组织产生荧光图像，由于该波段激发下产生的组织荧光信号波段分别在442nm-488nm和480nm-562nm范围。
31、进一步，步骤s204中，对于分类后不同颜色的探针轨迹坐标点，选用将探针轨迹点叠加到成像视频上。
32、另一方面，本发明提供一种面向术中切缘评估的生物分子指纹提取系统，所述系统用于实现根据本发明的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法。
33、进一步，所述系统包括近红外自体荧光成像子系统和拉曼光谱子系统，其中，近红外自体荧光成像子系统包括785nm激发光源、近红外相机和长通滤光片；拉曼光谱子系统包括可见光相机、785nm或1064nm窄带激发光源、拉曼探针和拉曼光谱仪。
34、进一步，所述拉曼探针包括带通滤光片、二向色镜、颜色块、装进24g针管并在末端烧制小球的多模光纤和长通滤光片。
35、有益效果：
36、(1)在近红外自体荧光图像获得的部分，采用对医生更为友好的785nm近红外光源激发，而不是紫外光源；
37、(2)采用近红外自体荧光成像替代原卟啉ix荧光成像，即无需提前对组织施加荧光剂，而是根据组织在785nm激光激发下产生大于810nm的自体荧光信号这一特性，生成较深层(约3cm)乳腺肿瘤/癌和正常组织的对比荧光图像。
38、(3)通过将末端烧制小球的多模光纤，装在24g细针中后，控制探针和组织的工作距离，实现生物组织拉曼光谱分子指纹探测。
39、(4)采用投影技术，将组织的近红外自体荧光信号对比图像，以及通过探针轨迹追踪方法描绘出的肿瘤/癌和正常组织切缘坐标点呈现在医生的手术视野中，减少医生临床翻译的时间和工作量，从而减少术中确认肿瘤/癌和正常组织切缘的时间。
1.一种面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，步骤s101中，采用两个650nm的激光笔进行定位，两个激光点在工作面上相交时，该系统的工作距离是30cm。
3.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，步骤s103中，在785nm激光激发下根据组织自身的特性产生大于810nm的近红外自体荧光信号。
4.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，步骤s202a中，采用785nm激光或1064nm激光进行激发。
5.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，步骤s203b中，探针尖端坐标点寻找算法流程如下：
6.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，步骤s103中，在自体荧光成像部分，采用365nm或405nm激光激发生物组织产生荧光图像，该波段激发下产生的组织荧光信号波段分别在442nm-488nm和480nm-562nm范围。
7.根据权利要求1所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法，其特征在于，对于步骤s204中得到的不同颜色的探针轨迹点，选用将探针轨迹点叠加到成像视频上。
8.一种面向术中切缘评估的生物分子指纹提取系统，其特征在于，所述系统用于实现根据权利要求1-7任一项所述的面向术中切缘评估的生物组织分子指纹提取方法。
9.根据权利要求8所述的面向术中切缘评估的生物分子指纹提取系统，其特征在于，所述系统包括近红外自体荧光成像子系统和拉曼光谱子系统，其中，近红外自体荧光成像子系统包括650nm定位激光笔、785nm激发光源、带通滤光片、长通滤光片、近红外相机、可见光相机、投影仪；拉曼光谱子系统包括785nm窄带激发光源、拉曼探针、拉曼光谱仪、可见光相机、投影仪。
10.根据权利要求9所述的面向术中切缘评估的生物分子指纹提取系统，其特征在于，所述拉曼探针包括带通滤光片、二向色镜、颜色块、装进24g针管并在末端烧制小球的多模光纤和长通滤光片。
