本发明涉及中药材鉴定，具体涉及一种硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法与应用。
背景技术：
1、紫草是我国传统中药材。传统用药为紫草科植物紫草(lithospermumerythrorhizon sieb.etzucc.)。紫草甘、咸，寒，归心包络、肝经，有凉血、活血、清热解毒的作用，紫草有抗肿瘤、制卵巢癌、抗菌、抗病毒、消炎、促肉芽生长等功效，主要用于温热斑疹、湿热黄疸、紫癜、吐、衄、尿血、淋浊和血痢、热结便秘、烧伤、湿疹、丹毒、痈疡、皮肤癌、红斑狼疮、带状疱疹、湿疹、天花、麻疹等疾病的治疗。
2、萘醌类、苯醌类、黄酮类、生物碱类及多糖类物质是紫草的主要活性成分，其中羟基萘醌类化合物的抗癌作用和较强的脂溶性特征是紫草主要药效成分，尤其是左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素等7种成分是紫草的主要物质成分。因此以紫草主要药效成分和指标性成分建立紫草的指纹图谱，为紫草的质量评价和控制提供更有力的依据，同时为其鉴别提供依据。
3、但现有的紫草主要分析方法如薄层扫描法(tlc)、紫外-可见分光光度法、气相色谱法(gc)、液相色谱法(hplc)等均难以将上述7种紫草的主要有效成分分离并建立指标性的检测标准，其导致难以精确判断和评价紫草的质量。
技术实现思路
1、本发明开创性地制备了一种硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法及应用，这种方法可以将硬紫草中的7种羟基萘醌类成分分离洗出，得到能分别定性和定量分析硬紫草中7种羟基萘醌类成分的指纹图谱，有利于硬紫草质量的更为全面、客观的评价。
2、硬紫草中的羟基萘醌类成分含量较多，也是其药效体现的主要活性成分之一，因此判断硬紫草中的羟基萘醌类成分的含量是判断硬紫草质量的重要指标之一。但由于硬紫草中羟基萘醌类成分的种类繁多，现有技术中提供的分离洗出方法难以将多种羟基萘醌类成分分别洗出，因此难以判断其中具体起到主要药效的羟基萘醌类成分具体是由哪一或者哪些成分提供，也难以明确培植条件的优化。故，将硬紫草中的羟基萘醌类成分尽可能多的分别分离洗出是评价和控制硬紫草质量的重要技术前提。
3、为实现上述目的，本发明拟采用以下技术方案：
4、本发明提供一种硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
5、(1)获取提取液，配制试样溶液：提供硬紫草，并利用石油醚作为提取溶剂，提取得到提取液；定量取提取液，定容，得到试样溶液；
6、(2)配制单一对照溶液：分别配置左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的单一对照溶液；
7、(3)分别取单一对照溶液注入液相色谱仪进行检测，得到单一对照溶液的色谱图；再取试样溶液注入液相色谱仪进行检测，得到试样色谱图，其色谱条件包括：
8、色谱柱：aq-c18柱：4.6×250mm，5μm；流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.025％-0.1％甲酸溶液，流动相的配比和流速随时间变化：
9、
10、(4)将步骤(3)得到的单一对照溶液的色谱图和试样色谱图利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012进行分析，确定左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的特征峰，得到紫草hplc指纹图谱。
11、进一步地，在本技术地一些实施例中，用于定容得到所述试样溶液的溶剂、配制所述单一样品溶液的溶剂、配制所述混合样品溶液的溶剂与流动相a相同。
12、进一步地，在本技术地一些实施例中，色谱条件还包括：检测波长：271-328nm；柱温：30-35℃。
13、进一步地，在本技术地一些实施例中，检测波长为275nm，柱温为35℃，流动相b为0.05％的甲酸水。
14、进一步地，在本技术地一些实施例中，所述左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的单一样品溶液的浓度为0.4mg/ml；所述β-羟基异戊酰紫草素的单一样品溶液的浓度为0.2mg/ml。
15、进一步地，在本技术地一些实施例中，所述混合对照溶液中左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的浓度分别为：0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml。
16、进一步地，在本技术地一些实施例中，以乙酰阿卡宁的特征峰为基峰，所述紫草hplc指纹图谱包括左旋紫草素的特征峰、β-羟基异戊酰紫草素的特征峰、去氧紫草素的特征峰、异丁酰紫草素的特征峰、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的特征峰、异戊酰紫草素的特征峰，其相对保留时间分别为：
17、其中左旋紫草素的特征峰的相对保留时间为：0.6950～0.7000；
18、其中β-羟基异戊酰紫草素的相对保留时间为：0.8400～0.8450；
19、其中乙酰阿卡宁的相对保留时间为：1.000；
20、其中去氧紫草素的相对保留时间为：1.3100～1.3150；
21、其中异丁酰紫草素的相对保留时间为：1.4730～1.4780；
22、其中ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的相对保留时间为：1.9000～1.9150；
23、其中异戊酰紫草素的相对保留时间为：2.1550～2.1700。
24、第二方面，本技术还提供上述得到的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱在硬紫草质量评价领域的应用。
25、进一步地，在本技术地一些实施例中，所述应用包括：将待质量评价的紫草的提取液的hplc的图谱与所述紫草hplc指纹图谱进行比对，判断所述紫草中的左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素各成分是否存在；并根据待质量评价的紫草的提取液的hplc的图谱，计算待质量评价的紫草中的左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的含量。
26、根据紫草中的左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的含量判断待质量评价的紫草的质量。
27、本发明的有益效果是：
28、本发明提供的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法采用乙腈-甲酸作为流动相，并随着通过特定的流动相变化，分离洗出7种羟基萘醌类成分，使其可以定性和定量检测硬紫草中的7种羟基萘醌类成分的含量，实现硬紫草中羟基萘醌类成分的多方面检测，完善其质量检测体系，进而为紫草的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。本发明提供的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法的得到的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱相较于现有的硬紫草hplc指纹图谱更完整、精度更高，更有利于推广应用。
1.硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：用于定容得到所述试样溶液的溶剂、配制所述单一样品溶液的溶剂、配制所述混合样品溶液的溶剂与流动相a相同。
3.根据权利要求1所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：色谱条件还包括：检测波长：271-328nm；柱温：30-35℃。
4.根据权利要求3所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：检测波长为275nm，柱温为35℃，流动相b为0.05％的甲酸水。
5.根据权利要求1所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的单一样品溶液的浓度为0.4mg/ml；所述β-羟基异戊酰紫草素的单一样品溶液的浓度为0.2mg/ml。
6.根据权利要求1所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述混合对照溶液中左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的浓度分别为：0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.04mg/ml。
7.根据权利要求1～6任一项所述的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱的建立方法，其特征在于：以乙酰阿卡宁的特征峰为基峰，所述紫草hplc指纹图谱包括左旋紫草素的特征峰、β-羟基异戊酰紫草素的特征峰、去氧紫草素的特征峰、异丁酰紫草素的特征峰、ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的特征峰、异戊酰紫草素的特征峰，其相对保留时间分别为：
8.权利要求1～7任一项得到的硬紫草羟基萘醌类成分hplc指纹图谱在硬紫草质量评价领域的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将待质量评价的紫草的提取液的hplc的图谱与所述紫草hplc指纹图谱进行比对，判断所述紫草中的左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素各成分是否存在；并根据待质量评价的紫草的提取液的hplc的图谱，计算待质量评价的紫草中的左旋紫草素、乙酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β-β-二甲基丙烯酰阿卡宁、β-羟基异戊酰紫草素、异戊酰紫草素以及去氧紫草素的含量。
