本发明属于生物医学，具体涉及引物探针组合及其在制备鉴别滑液囊支原体野毒株和ms-h株的试剂盒中的应用，尤其涉及一种区分滑液囊支原体野毒株和疫苗株(ms-h株)的实时荧光定量pcr试剂盒及其应用。
背景技术：
：：1、滑液囊支原体(mycoplasma synoviae，ms)感染主要发生于鸡和火鸡。临床症状主要表现为上呼吸道的亚临床感染、传染性滑膜炎和蛋壳尖端异常等。本病可通过种蛋垂直传播，也可通过呼吸道水平传播。一旦鸡群感染，根除非常困难，因此病情在鸡群中长期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高和产蛋量下降等问题。此外，ms易与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等其他病原混合感染，加剧病情，增加死亡率，造成严重经济损失。2、近年来，在我国家禽养殖业中鸡的ms感染日益严重，黄羽肉鸡、白羽肉鸡、肉杂鸡和蛋鸡都受到影响。当前，种群净化面临着巨大的困难和高昂的成本，与此同时，在无抗生素养殖的趋势下，抗生素的使用也受到严格限制。因此，疫苗免疫成为目前控制ms的重要手段。目前，世界范围内已经注册并投入临床应用的主要疫苗有澳大利亚生物资源公司生产的温度敏感型活疫苗vaxms(ms-h株)和msd公司生产的减毒活疫苗nobilis ms live(ms1株)。在中国，已经批准商品化应用的是温度敏感型(ts+)活疫苗(ms-h株)【(2017)外兽药证字33号】。3、活疫苗的应用不仅可以通过在上呼吸道定植对野毒株感染产生竞争排斥作用，还能产生有效的黏膜免疫应答，以达到阻断野毒感然的效果。因此，活疫苗在ms感染的综合防控中发挥了重要的作用。然而，活疫苗对野毒感染的竞争排斥作用并不是一蹴而就的，在较长的一段时间内野毒株感染后通常会和疫苗株在鸡体内共存，最终的阻断效果取决于双方竞争能力的差异。因此，在活疫苗免疫鸡群监测野毒感染时，需要一种能够准确区分疫苗免疫和野毒感染的方法(diva)。4、目前已报告多种区分ms-h疫苗株与ms野毒株的方法，如基于vlha基因prr区与rⅲ区序列分析(el-gazzar m m,wetzel a n,raviv z.the genotyping potential of themycoplasma synoviae vlha gene[j].avian diseases,2012,56(4):711-9.)的靶基因测序法和限制性片段长度多态性分析法(pcr-rflp)，或基于管家基因的mlst分型法(el-gazzar m,ghanem m,mcdonald k,et al.development of multilocus sequence typing(mlst)for mycoplasma synoviae[j].avian diseases,2017,61(1):25-32.)等。然而，这些方法通常需要测序，耗时耗力，且无法区分ms-h与其他澳大利亚野生株。另外，还有基于shahid m a等发现的obg基因367位的snp(shahid m a,markham p f,markham j f,etal.mutations in gtp binding protein obg of mycoplasma synoviae vaccine strainms-h:implications in temperature-sensitivity phenotype[j].plos one,2013,8(9):e73954.)建立的双探针检测方法(张小荣,陈梦瑶,吴艳涛,et al.一种鉴别滑液囊支原体野毒株与疫苗株ms-h的实时荧光定量pcr试剂盒,cn110699469b[p/ol].2022-08-09].)、高分辨率溶解曲线法(hrm)，错配扩增突变分析法(mama)，以及基于zhu l等发现的oppf基因468位移码(zhu l,konsak b m,olaogun o m,et al.identification of a new geneticmarker in mycoplasma synoviae vaccine strain ms-h and development of astrategy using polymerase chain reaction and high-resolution melting curveanalysis for differentiating ms-h from field strains[j].veterinarymicrobiology,2017,210(49-55.)建立的的hrm法和间接elisa法等。这些方法操作简单快速，具有良好的敏感性。然而，近年来的部分研究发现，ms-h疫苗临床使用后，部分ms-h再分离株的obg基因和oppf基因会回复为野生型(kordafshari s,shil p,marenda m s,etal.preliminary comparative analysis of the genomes of selected fieldreisolates of the mycoplasma synoviae vaccine strain ms-h reveals both stableand unstable mutations after passage in vivo[j].bmc genomics,2020,21(1):598.)，从而导致温度敏感特性的丧失(ts-)，这些ts-回复突变株在鸡群中的水平传播不会导致更高的致病性或更严重的临床症状(klose s m,omotainse o s,zare s,etal.virulence factors of mycoplasma synoviae:three genes influencingcolonization,immunogenicity,and transmissibility[j].frontiers inmicrobiology,2022,13(1042212.)，但是这部分回复突变的疫苗株会对野毒感染监测造成极大的干扰，产生部分野毒检测假阳性的结果。5、因此迫切需要寻找新的基因靶点，建立可以同时区分ms野毒和包括回复突变株在内的ms-h疫苗毒的特异性鉴别检测方法，作为现有基于obg基因和oppf基因snp位点建立的鉴别检测方法的有效补充，甚至完全替代现有方法。技术实现思路1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于ms-h疫苗株和野毒株之间的snp位点设计的引物探针组合在制备鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒中的应用。2、本发明还要解决的技术问题是提供了用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株及其回复突变株的引物探针组合。3、本发明最后要解决的技术问题是提供了可定量检测并区分滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒。4、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于ms-h疫苗株和野毒株之间的snp位点设计的引物探针组合在制备鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒中的应用，所述snp位点在msh_02330基因的第131位，所述滑液囊支原体野毒株的多态性位点为g，所述温度敏感型疫苗株多态性位点为a，所述引物探针组合中的引物对序列如seq id no.1以及seq id no.2所示，所述引物探针组合中的探针序列分别如seq idno.3和seq id no.4所示。5、本技术实现要素：还包括用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的引物探针组合，所述引物探针组合中的引物对序列如seq id no.1以及seq id no.2所示，所述引物探针组合中的探针序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。6、本
发明内容还包括鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒，其包含所述的引物探针组合。7、其中，所述探针的5′端分别标记有fam和vic报告基团，3′端均标记有mgb荧光淬灭基团。8、其中，所述试剂盒中还包括2×qpcr扩增预混液以及阳性标准品。9、其中，所述阳性标准品包括含有滑液囊支原体野毒株wvu 1853和疫苗株ms-h株的msh_02330基因片段的质粒。10、其中，所述野毒株wvu 1853和疫苗株ms-h株的msh_02330基因片段的序列如seqid no.8和seq id no.9所示。11、其中，用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株时，按照以下步骤进行：12、(1)提取待检样本的总dna；13、(2)建立荧光定量标准曲线，将阳性标准品质粒梯度稀释作为模板，以权利要求2中所述的引物探针组合进行荧光定量pcr扩增，用于建立标准曲线；14、(3)以步骤(1)提取的总dna为模板，以所述的引物对和探针进行荧光定量pcr扩增；15、(4)pcr反应过程中自动检测、采集荧光信号，仅在fam通道中有信号的鉴定为野毒株，仅在vic通道中有信号的鉴定为ms-h疫苗，同时根据标准曲线对待检样本中的病原含量进行定量。16、其中，步骤(2)荧光定量pcr的反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环，在60℃30s阶段收集信号。17、其中，步骤(2)的pcr扩增体系为20μl，其中包含10μl 2×qpcr probe mastermix，0.1～1.8μl 522899-f，0.1～1.8μl 522899-r，0.2～0.5μl 522899-pw，0.2～0.5μl522899-pv，2μl模板dna和无菌水。18、作为优选，步骤(2)的pcr扩增体系为20μl，其中包括10μl 2×qpcr probe mastermix、0.1μl 522899-f2、0.1μl 522899-r3、0.2μl 522899-pw、0.3μl 522899-pv、2μl模板dna和7.3μl无菌水。19、发明机理：本发明通过比对疫苗株ms-h、ms-h再分离株与ncbi数据库中已发表的ms野毒分离株的序列，发现编码假定蛋白msh_02330的基因131nt处(ms-h，cp021129.1，522899nt)，疫苗株ms-h及其再分离株为a碱基，而野毒分离株均为g碱基，推测snp位点可能为ms-h株及其再分离株特有的变异位点。本发明基于该snp位点(a/g)建立实时荧光定量pcr检测方法。20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明首次基于ms-h疫苗株与野毒株在msh_02330基因的第131位核苷酸位置的snp位点(a/g)的特征，设计了一对能扩增包含该snp位点特异片段的pcr引物，以及两条分别特异性识别疫苗株(ms-h株)和野毒株snp位点的mgb-taqman探针，发明了一种能够区分ms-h疫苗株(含ts-回复突变株)和野毒株的实时荧光定量pcr试剂盒。经过体外实验证明，本试剂盒具有高灵敏度、较强的特异性和良好的重复性，不仅能够准确区分ms温度敏感型疫苗株(ms-h株)和ms野毒株，而且还可以排除ts-回复突变株的影响。该试剂盒既可用于对已分离、培养和纯化的ms分离株进行鉴别，也可用于ms-h疫苗株在免疫鸡群中的复制效率评估和野毒感染情况监测。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.一种基于ms-h疫苗株和野毒株之间的snp位点的引物探针组合在制备鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒中的应用，所述snp位点在msh_02330基因的第131位，所述滑液囊支原体野毒株的多态性位点为g，所述温度敏感型疫苗株多态性位点为a，所述引物探针组合中的引物对序列如seq id no.1以及seq id no.2所示，所述引物探针组合中的探针序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
2.用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中的引物对序列如seq id no.1以及seq id no.2所示，所述引物探针组合中的探针序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
3.鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5ʹ端分别标记有fam和vic报告基团，3ʹ端均标记有mgb荧光淬灭基团。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括2×qpcr扩增预混液以及阳性标准品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品包括含有滑液囊支原体野毒株wvu 1853和疫苗株ms-h株的msh_02330基因片段的质粒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述野毒株wvu 1853和疫苗株ms-h株的msh_02330基因片段的序列如seq id no.8和seq id no.9所示。
8.权利要求4~7任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株时，按照以下步骤进行：
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2）荧光定量pcr的反应条件为：95℃5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环，在60 ℃ 30 s阶段收集信号。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2）的pcr扩增体系为20 μl，其中包含10 μl 2×qpcr probe master mix，0.1~1.8 μl 522899-f，0.1~1.8 μl 522899-r，0.2~0.5 μl 522899-pw，0.2~0.5 μl 522899-pv，2 μl模板dna和无菌水。
技术总结本发明公开了一种基于MS‑H疫苗株和野毒株之间的SNP位点设计的引物探针组合在制备鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的试剂盒中的应用。本发明还公开了用于鉴别滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株的引物探针组合及其试剂盒。本发明的试剂盒具有高灵敏度、较强的特异性和良好的重复性，不仅能够准确区分MS温度敏感型疫苗株（MS‑H株）和MS野毒株，而且还可以排除ts‑回复突变株的影响。该试剂盒既可用于对已分离、培养和纯化的MS分离株进行鉴别，也可用于MS‑H疫苗株在免疫鸡群中的复制效率评估和野毒感染情况监测。
技术研发人员：张小荣,陈梦瑶,吴艳涛,郭梦娇,张成成,薄宗义
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：技术公布日：2024/11/11
