本发明涉及植物组织培养，特别是涉及一种万寿菊花瓣原生质体的制备方法和瞬时转化方法。
背景技术：
1、万寿菊(tagetes erecta l.)花瓣富含叶黄素，是目前发现的叶黄素含量最高的植物之一，是国际公认的提取叶黄素的理想材料。叶黄素是一种天然的类胡萝卜素，在保护视觉、预防心血管疾病、抗癌、抗氧化等方面具有重要作用，它不能在人体内合成，只能通过饮食从外界摄取。提高叶黄素含量已成为分子生物学的研究热点，但是万寿菊稳定遗传转化体系周期长、效率低，严重制约了万寿菊基因功能的研究。原生质体是去除细胞壁的裸露细胞，容易吸收外界遗传物质，利用原生质体进行瞬时转化能够在短时间内将目标基因转入受体细胞，从而进行高效表达，已被广泛应用于亚细胞定位、基因表达分析、蛋白-蛋白互作、基因编辑等方面的研究，建立万寿菊原生质体制备及瞬时转化体系对加快万寿菊基因功能研究具有重要意义。
2、目前，植物原生质体制备在拟南芥、烟草、水稻等模式植物的研究较多，在花卉方面的相关报道较少，且用于原生质体制备的材料多为愈伤组织或叶片，目前尚无取材于万寿菊花瓣的原生质体研究报道。前期，发明人也以叶片为材料建立了万寿菊叶片原生质体制备体系(申请号：202410906980.5)，但是花瓣和叶片结构差异显著，采用万寿菊叶片原生质体制备体系无法获得良好的花瓣原生质体产量和活力。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种万寿菊花瓣原生质体的制备方法和瞬时转化方法，本发明在拟在前期基础上，经过不断的试验和探索，旨在建立万寿菊花瓣原生质体制备及瞬时转化体系，为万寿菊花瓣的基因功能研究提供技术支撑。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明提供了一种万寿菊花瓣原生质体的制备方法，包括以下步骤：
4、1)将未完全开放的万寿菊花朵进行预处理，得到预处理花瓣；
5、所述预处理的条件包括：在4℃下暗处理12～48h；
6、2)将所述步骤1)得到的预处理花瓣与酶解液混合、酶解，得到酶解物；
7、所述酶解的条件包括：温度为20～30℃，时间为8～12h；
8、3)将所述步骤2)得到的酶解物与w5溶液混合后过滤，将得到的滤液离心，得到的沉淀为万寿菊花瓣原生质体。
9、优选的，所述步骤1)预处理的条件还包括：4℃暗处理12～48h后，获取舌状花瓣，用质量百分含量为1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水清洗3～5次，吸干水分，处理成0.5～1mm宽的条状细丝，得到预处理花瓣。
10、优选的，所述步骤1)暗处理的时间为24h。
11、优选的，所述步骤2)预处理花瓣与酶解液的质量比为1:10；
12、所述酶解液的组分包括：纤维素酶1.0％、离析酶0.5％、甘露醇1.0mol/l、2-吗啉乙磺酸0.2mol/l、cacl21.0 mol/l、kcl 0.2mol/l、nah2po41.0 mol/l、牛血清蛋白0.1％，以上均为质量百分含量。
13、优选的，所述步骤2)所述预处理花瓣和酶解液混合后，在压力为0.08mpa下真空抽提30min，再酶解。
14、优选的，所述步骤3)酶解物与w5溶液的体积比为1:1；
15、所述w5溶液的组分包括：nacl 154mmol/l、cacl2·2h2o 125mmol/l、kcl5mmol/l、mes2mmol/l、葡萄糖0.5％，以上为质量百分含量。
16、优选的，所述步骤3)过滤的条件包括：使用70μm细胞过滤器过滤；
17、所述离心的条件包括：转速为2000rpm，时间为6min，升速和降速都为1。本发明还提供了一种万寿菊花瓣原生质体的瞬时转化方法，包括以下步骤：
18、a将上述技术方案所述制备方法得到的万寿菊花瓣原生质体经mmg溶液重悬，得到原生质体悬浮液；
19、b将所述步骤a得到的原生质体悬浮液与质粒溶液、转染溶液混合后孵育，得到孵育物；
20、c将所述步骤b得到的孵育物与w5溶液混合、离心，将得到的沉淀与培养液混合、培养，实现原生质体瞬时转化。
21、优选的，所述步骤a原生质体悬浮液的浓度为2～5×105个/ml；所述mmg溶液的组分包括：甘露醇400mmol/l+mgcl215 mmol/l+mes 4mmol/l。
22、所述步骤b原生质体悬浮液与质粒溶液、转染溶液的体积比为100:10:110；
23、所述质粒溶液的浓度为0.8～1.2μg/ml，所述质粒溶液中质粒为pgreenll-62-sk-35s-gfp；
24、所述转染溶液的组分包括：peg400040％+cacl2·2h2o 100mmol/l+甘露醇1.0mol/l；
25、所述孵育的条件包括：温度为20～30℃，时间为5min。
26、优选的，所述步骤c中w5溶液与原生质体悬浮液的体积比为44:10；
27、所述离心的条件包括：转速为2000rpm，时间为2min；
28、所述培养液的组分包括：kcl 20mmol/l+mes 4mmol/l+甘露醇1.0mol/l；
29、所述培养的条件包括：避光培养12～16h。
30、本发明的有益效果：
31、本发明以万寿菊花瓣为材料，预处理后使用酶解液酶解、分离、纯化原生质体，通过优化预处理条件、酶解时间等酶解条件，建立了高效、快捷的万寿菊花瓣原生质体制备体系。以万寿菊花瓣原生质体为受体转化外源gfp基因，且能成功表达，首次建立了万寿菊花瓣原生质体瞬时转化体系，为万寿菊基因功能验证、蛋白互作分析奠定了良好基础。
1.一种万寿菊花瓣原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)预处理的条件还包括：4℃暗处理12～48h后，获取舌状花瓣，用质量百分含量为1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水清洗3～5次，吸干水分，处理成0.5～1mm宽的条状细丝，得到预处理花瓣。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)暗处理的时间为24h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)预处理花瓣与酶解液的质量比为1:10；
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)预处理花瓣和酶解液混合后，在压力为0.08mpa下真空抽提30min，再酶解。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)酶解物与w5溶液的体积比为1:1；
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)过滤的条件包括：使用70μm细胞过滤器过滤；
8.一种万寿菊花瓣原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤a原生质体悬浮液的浓度为2～5×105个/ml；所述mmg溶液的组分包括：甘露醇400mmol/l+mgcl215 mmol/l+mes4mmol/l。
10.根据权利要求8所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤c中w5溶液与原生质体悬浮液的体积比为44:10；
