本发明属于微生物检测或鉴定领域，涉及一种肺炎克雷伯菌用引物组及用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒。
背景技术：
1、肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科、克雷伯菌属，是一种需氧的革兰阴性杆菌。肺炎克雷伯菌是常见的机会性致病菌，在正常人的口咽部的检出率达1％-6％，在住院患者中的检出率则可高达20％，其常感染具有基础疾病的患者，包括酒精中毒者，患糖尿病者或者患慢性阻塞性肺疾病者，可致肠外感染，包括尿路感染、肺炎、肝脓肿、内源性眼内炎、手术切口感染和危及生命的感染，如感染性心内膜炎和败血症。准确快捷的检测病患是否感染肺炎克雷伯菌，对临床诊治和用药具有重大的意义。
2、在病原体检测中，pcr法由于其快速简便的特点逐渐呈现出替代细菌培养法和血清学法的态势。引物和探针的特异性是pcr法特异性和敏感性的基础。目前多款市售试剂盒中，均只有一对引物和一条探针，在一个反应中只检测肺炎克雷伯菌一个靶标基因，由于肺炎克雷伯菌基因组的多样性，单基因检测必定会造成漏检的情况发生。
技术实现思路
1、为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种检测准确率高以及能满足相关临床检测的技术需求的肺炎克雷伯菌用引物组及用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种肺炎克雷伯菌用引物组，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌用引物组包括两组双重荧光定量pcr引物组合，所述肺炎克雷伯菌用引物组的序列信息是：
4、lptd-f：gcagcaaaccagatgttggg；
5、lptd-r：tcagaccgcgcaattcgata；
6、merr-f：ctaacgctcgccacaatcaag；
7、merr-r：aggactccagatcgggttca。
8、优选地，本发明还提供了如前记载的肺炎克雷伯菌用引物组在检测或鉴定肺炎克雷伯菌时的应用。
9、优选地，本发明所提供的肺炎克雷伯菌用引物组中的lptd-f以及lptd-r用于扩增肺炎克雷伯菌的lptd基因；所述肺炎克雷伯菌用引物组中的merr-f以及merr-r用于扩增肺炎克雷伯菌的merr基因。
10、优选地，本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌用探针，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌用探针包括lptd探针以及merr探针；
11、所述lptd探针的序列是：ctgctgctacgccatccgtcttgg；
12、所述merr探针的序列是：ctgtcgctgcccgagctgctg。
13、优选地，本发明所采用的lptd探针的5'端标记有荧光报告基团6-fam，所述lptd探针的3'端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述merr探针的5'端标记有荧光报告基团vic，所述merr探针的3'端标记有荧光淬灭基团bhq1。
14、优选地，本发明还提供了肺炎克雷伯菌用探针在检测或鉴定肺炎克雷伯菌时的应用。
15、优选地，本发明所提供的lptd探针探测肺炎克雷伯菌的lptd基因；所述merr探针探测肺炎克雷伯菌的merr基因。
16、优选地，本发明还提供了一种用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒包括阳性对照、阴性对照、probe qpcr mixmultiplus混合液、超纯水、如前所述的肺炎克雷伯菌用引物组以及如前所述的肺炎克雷伯菌用探针；所述阳性对照是标准质粒pmd18-t-lptd和pmd18-t-merr；所述阴性对照是超纯水。
17、优选地，本发明还提供了用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒对肺炎克雷伯菌进行检测或鉴定的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
18、1)获取待测样本；
19、2)以待测样本的基因组dna为模板，使用如前所述的用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒进行荧光定量pcr扩增，同时设定质量控制；
20、3)根据步骤2)的扩增结果，检测或鉴定待测样本是否存在肺炎克雷伯菌，得到检测或鉴定结果。
21、优选地，本发明所采用的步骤2)中pcr扩增的反应程序为：95℃预变性20s，95℃变性1s，65℃退火20s，反应40个循环，在65℃退火步骤结束时，采集荧光信号值；
22、所述步骤2)中pcr扩增的反应总体积是25μl，所述pcr扩增的反应体系是：probeqpcr mix multiplus 12.5μl，10μm的lptd-f 0.5μl，10μm的lptd-r 0.5μl，10μm的lptd探针0.6μl，10μm的merr-f 0.5μl，10μm的merr-r 0.5μl，10μm的merr探针0.6μl，dna模板2μl，超纯水7.3μl；
23、所述步骤2)中的质量控制是：每次实验应设立阴、阳性对照，其中阴性对照为超纯水，阳性对照为拷贝数是3.38×106copies/μl的pmd18-t-lptd和拷贝数是1.41×106copies/μl的pmd18-t-merr的等体积混合物；所述阴性对照无ct值或ct值为0；阳性对照ct值≤25；
24、所述步骤3)中的检测或鉴定结果包括待测样本阳性、待测样本可疑、待测样本阴性以及对监测或鉴定结果质疑；
25、所述待测样本阳性的判定条件是：双通道检测中，任何一个基因出现s型扩增曲线，ct值≤39；
26、所述待测样本可疑的判定条件是：任何一个基因出现s型扩增曲线，但ct值＞39；
27、所述待测样本阴性的判定条件是：没有出现s型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈s型；
28、所述对监测或鉴定结果质疑的，重复检测或鉴定，直至得到待测样本阳性、待测样本可疑或待测样本阴性。
29、本发明的有益效果：
30、本发明在发现肺炎克雷伯菌基因组中两个高度保守及特异的基因(lptd和merr)的基础上，采用一次反应，同时检测肺炎克雷伯菌的两个靶标基因，从而有效的解决了肺炎克雷伯菌临床检测的假阴性问题，应用显示其对临床分离株的检出率可达100％，满足了相关临床检测的技术需求，具体而言，本发明具有如下优点：
31、1)本发明所选的肺炎克雷伯菌lptd基因和merr基因均具备高度保守性与特异性。依据本发明中的两个基因设计的引物和探针具备高灵敏度和高特异性，其对易引起相似的临床症状微生物(肺炎链球菌)、潜在干扰物质血红蛋白、白细胞等人体样本均无扩增反应；其扩增特异性高、重复性好，其对随机抽取的320株肺炎克雷伯菌临床分离株的检出率达到100％，无漏检。
32、2)本发明检测或鉴定肺炎克雷伯菌的两个靶标基因的试剂盒具备高特异性和高灵敏度，适用于对肺炎克雷伯菌的快速检测，具有高效性、可靠性和简便性，适合推广应用。
33、3)本发明在对肺炎克雷伯菌检测时仅需一轮pcr扩增，且检测时间仅需1小时。通过taqman探针双重荧光定量pcr的方法，一管反应可同时检测肺炎克雷伯菌的两个具备高度保守及特异性的靶标基因(lptd蛋白基因和merr蛋白基因)，有效解决现有技术中肺炎克雷伯菌检测的假阳性和假阴性问题。
1.一种肺炎克雷伯菌用引物组，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌用引物组包括两组双重荧光定量pcr引物组合，所述肺炎克雷伯菌用引物组的序列信息是：
2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯菌用引物组在检测或鉴定肺炎克雷伯菌时的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌用引物组中的lptd-f以及lptd-r用于扩增肺炎克雷伯菌的lptd基因；所述肺炎克雷伯菌用引物组中的merr-f以及merr-r用于扩增肺炎克雷伯菌的merr基因。
4.一种肺炎克雷伯菌用探针，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌用探针包括lptd探针以及merr探针；
5.根据权利要求4所述的肺炎克雷伯菌用探针，其特征在于：所述lptd探针的5'端标记有荧光报告基团6-fam，所述lptd探针的3'端标记有荧光淬灭基团bhq1；所述merr探针的5'端标记有荧光报告基团vic，所述merr探针的3'端标记有荧光淬灭基团bhq1。
6.根据权利要求4或5所述的肺炎克雷伯菌用探针在检测或鉴定肺炎克雷伯菌时的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述lptd探针探测肺炎克雷伯菌的lptd基因；所述merr探针探测肺炎克雷伯菌的merr基因。
8.一种用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒包括阳性对照、阴性对照、probe qpcr mix multiplus混合液、超纯水、如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌用引物组以及如权利要求4或5所述的肺炎克雷伯菌用探针；所述阳性对照是标准质粒pmd18-t-lptd和pmd18-t-merr；所述阴性对照是超纯水。
9.一种基于如权利要求8所述的用于检测或鉴定肺炎克雷伯菌的试剂盒对肺炎克雷伯菌进行检测或鉴定的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中pcr扩增的反应程序为：95℃预变性20s，95℃变性1s，65℃退火20s，反应40个循环，在65℃退火步骤结束时，采集荧光信号值；
