背景技术：
0、背景
1、分析和表征生物和生化材料和系统的显著进步引起在了解生命、健康、疾病以及治疗机制方面的前所未有的进步。在这些进步中，靶向和表征生物系统的基因组构成的技术已经产生了一些最突破性的结果，包括在使用和开发基因扩增技术和核酸测序技术方面的进步。
2、核酸测序可被用于获得多种生物医学背景中的信息，所述生物医学背景包括诊断、预后、生物技术以及法医生物学。测序可能涉及：基本方法，包括马克萨姆-吉尔伯特测序(maxam-gilbert sequencing)和链终止法；或从头测序法，包括鸟枪测序和桥式pcr；或下一代法，包括聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、illumina测序、solid测序、ion torrent半导体测序、heliscope单分子测序、测序等
3、尽管在生物表征方面取得了这些进步，但许多挑战仍未得到解决，或通过现今所提供的解决方案得到相对较差地解决。本公开提供用于解决许多现有技术的不足之处的新型解决方案和办法。
4、简述
5、本文提供用于分析单个细胞或小细胞群体的方法、组合物以及系统，包括分析来自这些单个细胞或细胞群体的核酸以及将核酸归属至这些单个细胞或细胞群体。
6、本公开的一个方面提供一种分析来自细胞的核酸的方法，其包括将源于单个细胞的核酸提供至离散分区中；产生源于所述离散分区内的所述核酸的一个或多个第一核酸序列，所述一个或多个第一核酸序列已连接于包含共同核酸条形码序列的寡核苷酸；产生对所述一个或多个第一核酸序列或源于所述一个或多个第一核酸序列的一个或多个第二核酸序列的表征，所述一个或多个第二核酸序列包含所述共同条形码序列；并且至少部分基于在所产生的表征中存在所述共同核酸条形码序列将所述一个或多个第一核酸序列或一个或多个第二核酸序列识别为源于所述单个细胞。
7、在一些实施方案中，离散分区为离散微滴。在一些实施方案中，将寡核苷酸与源于单个细胞的核酸共分配至离散分区中。在一些实施方案中，将所述寡核苷酸中的至少10,000个、至少100,000个或至少500,000个与源于单个细胞的核酸共分配至离散分区中。
8、在一些实施方案中，提供连接至珠粒的寡核苷酸，其中珠粒上的各寡核苷酸包含相同的条形码序列，并且将珠粒与单个细胞共分配至离散分区中。在一些实施方案中，寡核苷酸可释放地连接至珠粒。在一些实施方案中，珠粒包括可降解珠粒。在一些实施方案中，在产生一个或多个第一核酸序列之前或期间，所述方法包括经由降解珠粒使寡核苷酸从珠粒释放。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括使一个或多个第一核酸序列从离散分区释放。
9、在一些实施方案中，产生表征包括对一个或多个第一核酸序列或一个或多个第二核酸序列进行测序。所述方法还可包括由一个或多个第一核酸序列或一个或多个第二核酸序列的序列组装单个细胞的基因组的至少一部分的连续核酸序列。此外，所述方法还可包括基于单个细胞的基因组的至少一部分的核酸序列来表征单个细胞。
10、在一些实施方案中，核酸从离散分区中的单个细胞释放。在一些实施方案中，核酸包括核糖核酸(rna)，诸如信使rna(mrna)。在一些实施方案中，产生一个或多个第一核酸序列包括在产生一个或多个第一核酸序列的条件下使核酸进行反转录。在一些实施方案中，反转录在离散分区中进行。在一些实施方案中，寡核苷酸被提供于离散分区中并且包含多聚胸苷酸(poly-t)序列。在一些实施方案中，反转录包括使多聚胸苷酸序列与核酸中的每一者的至少一部分杂交并且以模板定向的方式延伸多聚胸苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含促进多聚胸苷酸序列的杂交的锚定序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含随机引导序列，所述随机引导序列可为例如随机六聚体。在一些实施方案中，反转录包括使随机引导序列与核酸中的每一者的至少一部分杂交并且以模板定向的方式延伸随机引导序列。
11、在一些实施方案中，一个或多个第一核酸序列中的给定者与核酸中的给定者的至少一部分具有序列互补性。在一些实施方案中，离散分区至多包括多个细胞之中的单个细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸包含独特的分子序列区段。在一些实施方案中，所述方法可包括至少部分基于独特的分子序列区段的存在将一个或多个第一核酸序列或一个或多个第二核酸序列的单个核酸序列识别为源于核酸中的给定核酸。在一些实施方案中，所述方法包括基于独特的分子序列区段的存在测定给定核酸的量。
12、在一些实施方案中，所述方法包括在产生表征之前，将一个或多个额外序列添加至一个或多个第一核酸序列以产生一个或多个第二核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括在转换寡核苷酸的辅助下将第一额外核酸序列添加至一个或多个第一核酸序列。在一些实施方案中，转换寡核苷酸与一个或多个第一核酸序列的至少一部分杂交，并且以模板定向的方式延伸以使第一额外核酸序列与一个或多个第一核酸序列偶接。在一些实施方案中，所述方法包括扩增与第一额外核酸序列偶接的一个或多个第一核酸序列。在一些实施方案中，扩增在离散分区中进行。在一些实施方案中，扩增在使与第一额外核酸序列偶接的一个或多个第一核酸序列从离散分区释放之后进行。
13、在一些实施方案中，在扩增之后，所述方法包括将一个或多个第二额外核酸序列添加至与第一额外序列偶接的一个或多个第一核酸序列以产生一个或多个第二核酸序列。在一些实施方案中，添加一个或多个第二额外序列包括去除与第一额外核酸序列偶接的一个或多个第一核酸序列中的每一者的一部分以及使其与一个或多个第二额外核酸序列偶接。在一些实施方案中，所述去除经由对与第一额外核酸序列偶接(例如连接)的一个或多个第一核酸序列进行剪切来完成。
14、在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括使一个或多个第一核酸序列进行转录以产生一个或多个rna片段。在一些实施方案中，转录在使一个或多个第一核酸序列从离散分区释放之后进行。在一些实施方案中，寡核苷酸包含t7启动子序列。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括去除一个或多个rna序列中的每一者的一部分以及使额外序列与一个或多个rna序列偶接。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括使与额外序列偶接的一个或多个rna序列进行反转录以产生一个或多个第二核酸序列。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括扩增一个或多个第二核酸序列。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括使一个或多个rna序列进行反转录以产生一个或多个dna序列。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括去除一个或多个dna序列中的每一者的一部分以及使一个或多个额外序列与一个或多个dna序列偶接以产生一个或多个第二核酸序列。在一些实施方案中，在产生表征之前，所述方法包括扩增一个或多个第二核酸序列。
15、在一些实施方案中，核酸包括由单个细胞的rna的反转录产生的互补(cdna)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含引导序列并且被提供于离散分区中。在一些实施方案中，所述引导序列包括随机n-mer。在一些实施方案中，产生一个或多个第一核酸序列包括使引导序列与cdna杂交以及以模板定向的方式延伸引导序列。
16、在一些实施方案中，离散分区包含含有寡核苷酸的互补序列的转换寡核苷酸。在一些实施方案中，产生一个或多个第一核酸序列包括使转换寡核苷酸与源于核酸的核酸片段的至少一部分杂交以及以模板定向的方式延伸转换寡核苷酸。在一些实施方案中，产生一个或多个第一核酸序列包括将寡核苷酸连接至一个或多个第一核酸序列。在一些实施方案中，一个或多个第一核酸序列为源于核酸的核酸片段。在一些实施方案中，产生一个或多个第一核酸序列包括使寡核苷酸与核酸偶接(例如连接)。
17、在一些实施方案中，多个分区包括离散分区。在一些实施方案中，多个分区平均包含每个分区少于一个细胞。在一些实施方案中，多个分区中少于25％的分区不包含细胞。在一些实施方案中，多个分区包含包括具有至少一个分配的细胞的离散分区。在一些实施方案中，少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少于1％的离散分区包含超过一个细胞。在一些实施方案中，至少离散分区的子集包含珠粒。在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的离散分区包含至少一个细胞和至少一个珠粒。在一些实施方案中，离散分区包含分配的核酸条形码序列。在一些实施方案中，离散分区包含至少1,000个、至少10,000个或至少100,000个不同的分配的核酸条形码序列。在一些实施方案中，多个分区包括至少1,000个、至少10,000个或至少100,000个分区。
18、在另一方面，本公开提供一种表征多种不同细胞类型的群体中的细胞的方法，其包括将来自群体中的单个细胞的核酸提供至离散分区中；将包含共同核酸条形码序列的寡核苷酸连接至来自离散分区内的单个细胞的核酸的一个或多个片段，其中多个不同分区包含不同的共同核酸条形码序列；以及表征来自多个离散分区的核酸的一个或多个片段，并且至少部分基于共同条形码序列的存在将一个或多个片段归属于单个细胞；以及基于对多个离散分区中的一个或多个片段的表征来表征群体中的多个单个细胞。
19、在一些实施方案中，所述方法包括将核酸片段化。在一些实施方案中，离散分区为微滴。在一些实施方案中，表征核酸的一个或多个片段包括对单个细胞的核糖体脱氧核糖核酸进行测序，并且表征细胞包括识别细胞属、种、株或变体。在一些实施方案中，单个细胞源于微生物组样品。在一些实施方案中，单个细胞源于人组织样品。在一些实施方案中，单个细胞源于哺乳动物中的循环细胞。在一些实施方案中，单个细胞源于法医样品。在一些实施方案中，核酸从离散分区中的单个细胞释放。
20、本公开的额外方面提供表征单个细胞或细胞群体的方法，其包括在允许一个或多个细胞表面特征物结合基与其各自的细胞表面特征物(若存在)之间结合的条件下，将细胞与多种不同的细胞表面特征物结合基类型一起孵育，其中各种不同的细胞表面结合基类型能够结合于不同的细胞表面特征物，并且其中各种不同的细胞表面结合基类型包含与其缔合的报告寡核苷酸；将细胞分配至包含含有条形码序列的多个寡核苷酸的分区中；将条形码序列连接至存在于分区中的寡核苷酸报告基；对寡核苷酸报告基和连接的条形码进行测序；以及基于测序的报告寡核苷酸来表征存在于细胞上的细胞表面特征物。
21、本公开的额外方面提供一种包含多个分区的组合物，多个分区中的每一者包含单个细胞和包含共同核酸条形码序列的寡核苷酸群体。在一些实施方案中，多个分区包括乳液中的微滴。在一些实施方案中，多个分区中的每一者内的寡核苷酸群体与设置于多个分区中的每一者内的珠粒偶接。在一些实施方案中，单个细胞已与同各自的细胞表面特征物缔合的多个不同的细胞表面特征物结合基缔合，并且各种不同类型的细胞表面特征物结合基包含含有不同核苷酸序列的寡核苷酸报告基。在一些实施方案中，多个不同的细胞表面特征物结合基包括对多个不同的细胞表面特征物具有结合亲和力的多个不同的抗体或抗体片段。
22、由以下详细描述，本公开的额外方面和优点对本领域技术人员来说将变得轻易地显而易见，在以下详细描述中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到的，本公开能够实现其他和不同实施方案，并且在各种明显的方面其若干细节能够进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，图式和描述将被视为在本质上是说明性的，而不是限制性的。
23、以引用的方式并入
24、本说明书中提到的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式并入本文中，其程度如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示以引用的方式并入一般。以引用的方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容矛盾的情况下，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
技术实现思路
1.一种分析来自细胞的核酸的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述离散分区为离散微滴。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在(a)中，将所述寡核苷酸与源于所述单个细胞的所述核酸共分配至所述离散分区中。
4.如权利要求3所述的方法，其中，在(a)中，将所述寡核苷酸中的至少10,000个与源于所述单个细胞的所述核酸共分配至所述离散分区中。
5.如权利要求4所述的方法，其中，在(a)中，将所述寡核苷酸中的至少100,000个与源于所述单个细胞的所述核酸共分配至所述离散分区中。
6.如权利要求5所述的方法，其中，在(a)中，将所述寡核苷酸中的至少500,000个与源于所述单个细胞的所述核酸共分配至所述离散分区中。
7.如权利要求1所述的方法，其中，在(a)中，提供连接至珠粒的所述寡核苷酸，其中珠粒上的各寡核苷酸包含相同的条形码序列，并且将所述珠粒与所述单个细胞共分配至所述离散分区中。
8.一种表征多种不同细胞类型的群体中的细胞的方法，其包括：
9.一种表征单个细胞或细胞群体的方法，其包括：
10.一种组合物，其包含多个分区，所述多个分区中的每一者包含(i)单个细胞，以及(ii)包含共同核酸条形码序列的寡核苷酸群体。
