本发明属于分子生物技术与基因工程，更具体地说，涉及一种‘赣彤1号’樟树高质量原生质体的制备方法。
背景技术：
1、原生质体(protoplast)是指脱去全部或部分细胞壁的细胞，它是由质膜所包围的具有生活力的“裸露细胞”。原生质体是细胞壁以内各种结构的总称，包括细胞膜、细胞质、细胞核和细胞器等。它是组成细胞的一个形态结构单位，活细胞中各种代谢活动均在此进行。
2、原生质体是植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物。原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的原生质体，它保持原细胞的一切活性。
3、制备原生质体首先需要选择供融合的两个亲株。要求亲株的性能稳定并带有遗传标记，一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记，以利于融合子的选择。为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数期后期的菌体进行酶处理，这个时期细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感，原生质体形成率高，再生率也高。获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的，原生质体制备中的主要影响因素有菌体的预处理、脱壁酶、渗透压稳定剂、反应温度、酶解时间等，由于各种微生物细胞壁的组成不同，破壁所用的酶的种类、浓度、破壁处理温度、时间、ph均有不同，须采用不同的原生质体制备方法。
4、在20世纪70年代开始了原生质体的超低温保存研究。有些植物只有在一年的某个特定时期才能成功分离原生质体，超低温保存的原生质体可以随时为研究提供所需的材料，并且是研究植物低温伤害及细胞内结冰的好材料。目前，原生质体已用于一些作物(如玉米、小麦、大豆、曼陀罗、番茄、柑橘等)的超低温保存。但是由于樟树叶片次生代谢物过于丰富，会严重影响提取效率，分离叶肉原生质体较为困难，所以至今仍未建立系统完整的樟树原生质体分离体系。
5、在玉米中，为了减少叶绿体的影响，研究人员将玉米从幼苗开始进行暗培，使叶片黄化再提取原生质体，但是由于樟树叶肉细胞较小，叶绿体过多，常常影响对转化后激发荧光的判断。原生质体易于摄取外来dna，病毒等，且有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养，是一种理想的植物受体。目前，已经在番茄、月季、曼陀罗等多种植物中，利用原生质体再生成完整的植株。但是由于樟树次生代谢物过多，利用组织器官发生建立遗传转化体系有一定难度。所以至今仍未建立稳定的樟树遗传转化体系。
6、因此，建立一个高效的樟树原生质体转化体系，利用樟树原生质体再生成完整植株，对樟树后续研究的开展将有重大意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种‘赣彤1号’樟树高质量原生质体的制备方法，用于制备高质量的‘赣彤1号’樟树原生质体。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
3、一种‘赣彤1号’樟树高质量原生质体的制备方法，将‘赣彤1号’樟树组培苗叶片置于小于0.6m甘露醇、2％-2.6％纤维素酶和0.4％-0.8％果胶酶的组合酶液中进行酶解，最终得到高质量的‘赣彤1号’樟树原生质体。
4、所述甘露醇浓度为0.56m。
5、所述纤维素酶浓度为2.2％。
6、所述果胶酶浓度为0.7％。
7、任一所述的制备方法，具体步骤包括：
8、1)在10ml试管中分别加入0.56m的甘露醇、20mm的脂肪酸甲酯磺酸盐、50mm的kcl，剩余用ddh2o补齐，混合后放入70℃水浴锅，水浴5min；
9、2)向试管中加入2.2％的纤维素酶和0.7％的果胶酶，混匀后放入55℃水浴锅中，水浴10min；
10、3)待其温度降至室温后，向其中加入0.1％的bsa，并缓慢混匀；
11、4)加入10mm的cacl2，混匀后将溶液用0.45nm的水系滤膜过滤到6孔板中；
12、5)取生长状态良好且平展的樟树组培苗叶片，将其切成0.5mm左右的条状，立即将切好的叶片浸泡于步骤4)制备好的酶液中；
13、6)将6孔板放入带盖的纸盒中，28℃，暗培4h，每隔2h取出纸盒手动轻柔摇动1-2min；
14、7)4h后取出6孔板，向酶液加入等体积的w5溶液以终止反应；
15、8)将50ml圆底离心管提前置于冰盒中预冷5min，用200目细胞筛将步骤7)所得混合液全部筛入50ml离心管中；
16、9)将离心机预冷至4℃，900rpm，加速度和减速度设为4，离心7min；
17、10)取出离心管并在冰盒中静置2min以彻底沉淀悬浮的原生质体，弃上清；
18、11)向离心管中加入1-2ml的w5溶液，并在掌心轻柔旋转拨动试管底部，以重悬原生质体，最终得到高质量的‘赣彤1号’樟树原生质体。
19、一种‘赣彤1号’樟树原生质体的瞬时转化方法，包括：
20、将‘赣彤1号’樟树组培苗叶片置于0.56m甘露醇、2.2％纤维素酶、0.7％果胶酶的组合酶液中进行酶解，最终得到高质量的‘赣彤1号’樟树原生质体；将‘赣彤1号’樟树原生质体置于含有目的基因表达载体质粒和15％-40％ peg的混合溶液中转化10-20min，最终获得转基因‘赣彤1号’樟树原生质体。
21、所述peg的浓度为15％。
22、所述遗传转化时间为20min。
23、任一所述的瞬时转化方法，具体步骤包括：
24、1)于10ml无菌离心管中加入0.2m的dm、0.1m的cacl2、15％的peg·4000，剩余用ddh2o补齐；
25、2)吸取100μl的摇匀后的原生质体加入无菌2ml离心管中，分别加入1μg的目的基因表达载体质粒，用手轻拨试管混匀，再加入110μl的步骤2)所得混合液，并立即轻拨试管混匀，室温静置20min；
26、3)加入500μl的w5溶液，轻拨混匀以终止反应；
27、4)在4℃条件下，以1,000rpm离心5min，去除上清；
28、5)加入100μl的wi溶液，轻拨混匀，室温静置10min；
29、6)室温环境下暗培16-20h，最终获得转基因‘赣彤1号’樟树原生质体。
30、与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31、1)本发明实施例结果表明：当甘露醇(dm)浓度为0.56m，纤维素酶浓度为2.2％，果胶酶浓度为0.7％时，原生质体分离效率最高，且形态完整。在5ml的体系中，从100mg叶组织中获得约1.2×106个原生质体。经fda染色鉴定，所产生的原生质体存活率约为95％，黑暗培养72h后，经fda染色鉴定，存活率为63.3％，该方法获得了高产量和高质量的樟树叶肉原生质体。
32、2)本发明实施例结果表明：以本发明制得的樟树叶肉原生质体为受体材料进行遗传转化时，当使用15％ peg转化20min时转化效率相对较高，转化效率为40％。peg介导的转染和过夜孵育后，在樟树叶肉原生质体的细胞质和细胞核中清楚地检测到gfp荧光，在构建的gfp融合载体35s::ccmyb4_like-gfp、35s::ccmyb10_like-gfp和35s::cctt2_like-gfp中也有相同现象。
33、3)本发明建立的原生质体提取体系能够高效快速的提取樟树叶肉原生质体，在6h内就可以完成提取工作，并且原生质体完整性好、活性高。
34、4)本发明对peg的浓度以及转化时间进行相应调整，降低了原生质体转化后大面积的原生质体破碎或粘连现象。
1.一种‘赣彤1号’樟树高质量原生质体的制备方法，其特征在于，将‘赣彤1号’樟树组培苗叶片置于小于0.6m甘露醇、2％-2.6％纤维素酶和0.4％-0.8％果胶酶的组合酶液中进行酶解，最终得到高质量的‘赣彤1号’樟树原生质体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘露醇浓度为0.56m。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶浓度为2.2％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果胶酶浓度为0.7％。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
6.一种‘赣彤1号’樟树原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述peg的浓度为15％。
8.根据权利要求6所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述遗传转化时间为20min。
9.根据权利要求6-8任一所述的瞬时转化方法，其特征在于，具体步骤包括：
