本发明属于人类疾病动物模型领域，具体涉及一种改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法。
背景技术：
1、抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，anca)相关性血管炎(anca-associatedvasculitis，aav)，一种罕见的异质性疾病，以中小血管的炎症和坏死为主要特征，并伴随循环血清anca的存在。该系统性血管炎主要分三种临床亚型：肉芽肿伴多血管炎(gpa)、显微镜下多血管炎(mpa)和嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(egpa)。该病可累及全身多个系统，以肺脏、肾脏损害最为常见。其病变复杂多样，患者较为少见，故临床上漏诊、误诊的情况时有发生；如不及早诊断与治疗，快速进展的肺损害和肾损害直接威胁患者的生命安全。近年来，免疫抑制剂的应用使得aav从危及生命的重大疾病转变成一种极易复发的慢性疾病，而激素及免疫抑制剂带来的毒副作用，如:心血管疾病、感染、血栓等直接危害患者的生命健康以及极大降低生活质量。
2、动物模型，现代生物医学研究中一个极为重要的实验方法和手段，人类可利用动物模型研究各疾病的发生、发展规律以及防治疾病疗效的机理，其优越性获得了无数科研工作者的青睐：1、避免了在人身上进行实验所带来的风险；2、临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来；3、可以克服人类某些疾病潜伏期长、病程长和发病率低的缺点；4、可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性；5、可以简化实验操作和样品收集；6、有助于更全面地认识疾病的本质。针对aav的低发病率与实质性的疾病异质性，人们更需要通过动物模型探究其内在发病机制，寻找药物靶向治疗的新方向。迄今为止，常见的anca相关性血管炎的动物模型构建的方式(mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型为例)主要有：1、抗mpo抗体、脾细胞或mpo特异性t细胞的被动转移；2、mpo主动免疫诱导；3、药物诱导法(肉豆蔻酸乙酸佛波酯与丙基硫氧嘧啶的联合给药)。而pr3-aav的动物模型构建方法与上述方法类似。上述的造模方法存在许多不足之处：1、现行的大部分动物模型病理变化较人类疾病的病理变化轻微，与人类疾病的相关性有待进一步提高。2、造模方法复杂繁琐，实验周期长，多数依赖于外源性抗体的被动转移，不属于真正意义上的自身免疫反应。3、造模方法所用到的抗体/抗原价格昂贵，不易获得，无疑增加造模的实验成本。因此，上述造模方法仍需进行改进。目前，药物诱导的aav动物模型以nakazawa等人公开的肉豆蔻酸乙酸佛波酯与丙基硫氧嘧啶的联合诱导mpo-aav动物模型的方法为代表：给予阳性对照组wky大鼠连续28天口服ptu10 mg/kg/day，第0天和第7天依次腹腔注射1ug pma。经这两种药物处理的wky大鼠表现为血清mpo-anca阳性，肾功能指标(血清尿素氮、肌酐)升高，伴随蛋白尿、血尿倾向。病理结果提示，药物诱导后的的大鼠肺部呈血管炎样改变，肾脏表现为肾小球局灶节段性增生和炎性细胞浸润且无免疫复合物沉积，可同时损伤肺脏和肾脏。不足的是肾脏病理改变较人类轻微，仅小部分肾小球发生节段性增生伴炎症浸润，肾小球内未见新月体形成，无纤维素渗出等。在现有的技术基础上，本发明要解决的问题是：加重mpo-aav大鼠的肾脏病理改变，如肾脏表现为新月体性肾小球肾炎/肾小球内产生新月体。故，大胆提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，所述的构建方法为应用pma与ptu共同诱导处于忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的动物出现肺血管炎病变、新月体性肾炎以及肾功能恶化等病理改变。安全的药物剂量使得处于忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的大鼠肺血管炎病变等愈之严重，其病理表现的维持时间也得到有效延长。
2、为了实现上述目的，将采用以下技术方案：
3、一种改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：应用肉豆蔻酸乙酸佛波酯(phorbol myristate acetate，pma)和丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，ptu)共同诱导处于忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的动物产生肺血管炎病变、新月体性肾炎以及肾功能恶化等病理改变。
4、进一步地，产生所述忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的方法为选取特定品系大鼠——wistar kyoto大鼠(wky大鼠)，wky大鼠由wistar大鼠近交而得，具备特定遗传背景，需预定购入。
5、进一步地，所述忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的wky大鼠需采用lad001饲料或ain93标准饲料喂养，高盐、高糖以及高脂饲料等会影响wky大鼠的内分泌和血压。
6、优选地，24小时提供饮用水。
7、进一步地，所述的wky大鼠经采用lad001饲料或ain93标准饲料喂养的方法严格执行并给予动物良好的生活环境可确认忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态。
8、进一步地，所述pma和ptu共同诱导的方法包括：向wky大鼠腹腔注射pma诱导nets，同时给予口服ptu。
9、进一步地，向所述wky大鼠腹腔注射pma的剂量为1ug/day。
10、进一步地，向所述wky大鼠腹腔注射pma的时间为造模第0天、第7天。
11、进一步地，向所述wky大鼠给予口服ptu的计量为20mg/kg/day。
12、进一步地，向所述wky大鼠给予口服ptu的时间连续4周。
13、进一步地，所述动物为wky大鼠，所述wky大鼠为雄性wky大鼠。
14、与当前广泛应用的造模技术相较，本发明在构建aav(抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎)大鼠模型领域展现出了几项显著的技术优势，这些优势不仅深化了我们对疾病模型稳定性的理解，还极大地提升了实验效率与成本效益，为aav及相关疾病的研究开辟了新的道路。
15、(1)创新性的联合诱导策略
16、本发明将wky(wistar-kyoto)大鼠作为实验对象，通过精心设计的ptu(丙基硫氧嘧啶)日口服量倍增方案，与pma(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)相结合，实现了对aav动物模型的高效诱导。这一策略不仅相较于传统方法提高了模型构建的稳定性与成功率，也可简化操作流程和降低实验成本。更重要的是，它证明了ptu与pma联合诱导的可行性，为aav乃至更广泛自身免疫性疾病的动物模型构建提供了更多的思路和方法，极大地拓宽了药物诱导动物模型在科研和临床应用中的前景。
17、(2)高度模拟人类疾病特征的模型
18、本发明进一步探索了双倍剂量ptu与pma联合使用的潜力，这一大胆尝试不仅使得构建的aav大鼠模型在稳定性、成功率和效率上达到了新的高度，更重要的是，该模型在病理生理表现上更加贴近人类mpo-aav(髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎)的真实情况。具体而言，模型大鼠血清中anca(抗中性粒细胞胞浆抗体)的阳性表达，肺部血管炎样病变的明确呈现，以及血尿素氮、肌酐水平的显著升高，均是对人类疾病特征的更精准模拟。此外，活动期伴随的血尿、蛋白尿，以及肾脏病理上肾小球局灶节段性增生、炎性细胞浸润和新月体性肾小球肾炎的形成，更是为研究人员提供了一个更加完美的疾病模拟平台。这一模型不仅为研究mpo-aav的发病机制提供了强有力的工具，还为探索新型治疗药物及评估其疗效提供了可靠的实验模型，具有不可估量的实用价值。
19、综上所述，本发明的研究不仅是对现有造模技术的一次重要革新，更是对推动aav及相关疾病研究向更深层次发展具有重要意义。其展现出的技术优势和应用潜力，无疑将为未来的科学研究和临床应用带来更加广阔的空间和可能。
1.一种改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：应用肉豆蔻酸乙酸佛波酯和丙基硫氧嘧啶共同诱导处于忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的动物产生肺血管炎病变、新月体性肾炎以及肾功能恶化的病理改变。
2.根据权利要求1所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，产生所述忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态的方法为选取特定品系大鼠——wky大鼠，所述的wky大鼠由wistar大鼠近交而得。
3.根据权利要求2所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，所述的wky大鼠采用lad001饲料或ain93标准饲料喂养。
4.根据权利要求3所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，所述的wky大鼠经采用lad001饲料或ain93标准饲料喂养的方法严格执行并给予动物良好的生活环境可确认忧郁焦虑、内分泌异常且容易应激状态。
5.根据权利要求1所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，所述肉豆蔻酸乙酸佛波酯和丙基硫氧嘧啶共同诱导的方法包括：向wky大鼠腹腔注射pma诱导nets，同时给予口服ptu。
6.根据权利要求5所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，向所述wky大鼠腹腔注射pma的剂量为1ug/day。
7.根据权利要求5所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，向所述wky大鼠腹腔注射pma的时间为造模第0天、第7天。
8.根据权利要求5所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，向所述wky大鼠给予口服ptu的计量为20mg/kg/day。
9.根据权利要求5所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，向所述wky大鼠给予口服ptu的时间连续4周。
10.根据权利要求1所述的改良后的mpo-aav相关性实验性血管炎动物模型构建方法，其特征在于，所述动物为wky大鼠，所述wky大鼠为雄性wky大鼠。
