本技术涉及抗体检测的，尤其涉及一种抗mog抗体检测材料及其制备方法和应用、利用该检测材料的试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin-oligodendrocyte glycoprotein，mog）为免疫球蛋白超家族的成员，特异性表达于少突胶质细胞膜表面以及髓鞘最外层，其表达量能够反映髓鞘化的程度。mog具有调节细胞间黏附、骨架蛋白以及介导髓鞘与免疫细胞间联系的作用。数十年来，mog被认为是中枢神经系统（central nervous system，cns）脱髓鞘疾病的可疑抗原，且被应用于建立多发性硬化（multiple sclerosis，ms）的动物模型，即实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，eae）小鼠，其免疫原性及反应性在动物模型中得到了充分验证。研究发现，有抗mog完整空间构象的抗体能够介导中枢脱髓鞘作用，并证实抗mog抗体的检出可见于部分急性播散性脑脊髓炎（acutedisseminated encephalomyelitis，adem）患者，而在ms中罕见。mog抗体相关疾病（myelin-oligodendrocyte glycoprotein antibody-associated disease，mogad）最常出现的3种临床表现，即adem、视神经炎、脊髓炎。
2、抗mog抗体在外周血液中产生，故首选的检测样品为血清，脑脊液检测仅提供补充信息。血清中抗mog抗体阳性为诊断mog抗体相关疾病的标准。早期抗mog抗体的检测技术不成熟，仅能凭借蛋白免疫印记法及elisa法检测抗mog抗体，检测结果不一致，存在误差。随着检测技术的提升，细胞底物实验（cba）检测方法诞生，该方法能够筛选天然蛋白质，临床上自身免疫性疾病的抗体常使用该方法进行检测。该方法具有高敏感性、高特异性。2001年首次采用cba检测方法检测出ms患者存在抗mog抗体。2018年国际mog抗体相关疾病指南提出，cba检测方法为抗mog抗体的最佳检测方法，从此cba检测方法检测抗mog抗体在临床应用逐渐增多，对mog抗体相关疾病的研究也逐渐增多。有研究发现，抗mog抗体滴度与疾病的活动性有关，具体表现为：急性期的抗mog抗体滴度大于缓解期的抗mog抗体滴度；长期持续抗mog抗体阳性的患者更易复发；抗mog抗体滴度高的mog抗体相关疾病更易复发。而通过对患者血清中抗mog抗体滴度的检测，分析抗mog抗体随疾病复发的变化情况，可以指导临床医生对不同患者采用不同的治疗策略，最终降低复发风险和残疾风险，提高预后水平。
3、传统的蛋白免疫印迹法和elisa法检测无法获得mog完整的空间构象，亲和力较低，而cba检测方法中，由于在细胞膜表达的mog处于自然状态，mog识别表位完全暴露，能够有效地与抗mog抗体结合，更贴近体内的反应环境。近年来，随着cba检测方法检测mog抗体相关疾病在临床诊断上的普及，如何灵敏、高效且特异性的检测到患者血清（或脑脊液）中的抗mog抗体，并通过抗体滴度来判断病情的严重性是至关重要的。
4、cba检测方法在前期制备抗原片的过程中，需要将完整的mog基因cds区序列拷贝后插入到载体中，经过大量克隆后得到含有目的基因的mog质粒；再将其转染到细胞（例如hek293t细胞）中使其能在细胞膜过表达mog抗原，从而获得表达mog的抗原片；之后经过固定染色等处理制成成品试剂盒。而在利用成品试剂盒检测患者血清（或脑脊液）时，细胞染色形态、判读的抗体滴度、呈现的结果稳定性等都会对诊断结果产生重要的影响。
5、再者，从ncbi基因库中直接获取的mog基因cds区序列表达后，会对细胞本身产生毒性，导致细胞大量死亡，从而对检测结果的判断造成影响。同时，直接应用该段序列，在结果呈现时，细胞染色形态偏圆，阴性对照组有大量非特异性染色，从而干扰抗体滴度的判读，尤其是弱阳样本。此外，细胞在转染后的表达效率也是影响结果判断的关键因素，普通的瞬转模式下，可以通过控制细胞的状态和转染体系来调整细胞中mog表达使其达到最优，但上限较低，在检测弱阳性样本时极易出现漏检，而且瞬时转染中还需要控制细胞转染后的密度，防止细胞过度生长对细胞染色形态的影响。而成品抗原片对于抗原的稳定保存也是非常重要的，在不加以干预的条件下，抗原蛋白在温度、湿度等影响下非常容易降解，容易造成检测结果的不稳定。
6、因此，如何使抗mog抗体的检测更加准确、灵敏，亟待进一步研究。
技术实现思路
1、本技术提供一种抗mog抗体检测材料及其制备方法和应用、利用该检测材料的试剂盒及检测方法。
2、本技术旨在构建抗mog抗体检测的cba方法学，并研发了能有效且快速检测血清中抗mog抗体的cba检测方法，可用于临床辅助诊断以及实验室科研使用。
3、本技术通过糖基化位点突变、低温配合诱导剂（例如表皮细胞生长因子egf）诱导、加入抗原保护剂，在cba检测方法中使细胞染色形态更加清晰完整，结果判读更易分辨；降低非特异染色的影响；延长了抗原保存时长，使检测结果更加稳定，从而提高抗mog抗体以及mog抗体相关疾病检测的准确性和灵敏度。
4、本技术中，由于表达的mog集中在细胞膜上，经固定后能完整地保存抗原结合位点和空间构像，相比于传统的蛋白免疫印迹法和elisa法需要破坏蛋白的二级结构或者抗原被包被而占据部分空间结合位点，cba检测方法中抗原与抗体结合的亲和度更高，且更接近体内的真实反应环境，对mog抗体相关疾病的诊断也更具说服力。
5、第一方面，本技术提供一种编码mog的核苷酸序列。
6、一种编码mog的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括如seq id no：1所示的核苷酸序列。
7、第二方面，本技术提供一种抗mog抗体检测材料的制备方法，采用如下技术方案：
8、一种抗mog抗体检测材料的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
9、（1）构建上述编码mog的核苷酸序列的重组质粒；
10、（2）将所述重组质粒转染至细胞，并置于低温下培养，同时加入诱导剂诱导，获得表达mog基因的细胞爬片；所述细胞为hek 293t细胞；
11、所述低温下培养所用的温度为25-35℃，培养时间为48-72h；
12、加入所述诱导剂的时机为转染后培养的5-8h内；通过添加所述诱导剂增加细胞膜的延展性；
13、（3）先利用固定液固定所述表达mog基因的细胞爬片，再利用蛋白保护剂保护所述表达mog基因的细胞爬片，即得抗mog抗体检测材料；
14、所述蛋白保护剂为质量浓度为2-15%的糖类与摩尔浓度为0.1-1.0mmol/l的蛋白酶抑制剂组成的混合溶液。
15、本技术中，目的基因为带有糖基化位点突变的mog基因cds区序列。糖基化位点是指蛋白质分子上能够被糖基化修饰的特定氨基酸残基，通过确定蛋白质中的糖基化位点，可以了解糖基化对蛋白质结构和功能的影响，进而调节其生物活性和药理特性。本技术中，通过在线预测软件，预测mog蛋白序列的糖基化位点，进而对其序列进行突变，改变mog蛋白结构，降低细胞表达后的毒性效果，同时改善染色后的阳性细胞形态。
16、本技术中，转染后的培养通过低温条件与诱导剂诱导相互配合。一方面，细胞在低温条件下生长速度缓慢，便于控制细胞密度；另一方面，加入诱导剂会促进细胞生长，配合低温培养条件，可以使细胞生长而不大量增殖，细胞膜表面积增大，有利于mog的过表达。
17、在染色形态方面，诱导前细胞膜为正常生长状态，染色形态较圆；诱导后由于细胞膜面积增加，从染色呈现的结果上看，细胞形态更加舒展，部分出现触手状结构。
18、在表达丰度方面，细胞在转染后会表达目的蛋白，一定时间内目的蛋白的表达量会随着培养时间的延长而增加，直到细胞密度达到90%以上，细胞内会富集大量的目的蛋白，从染色结果的呈现上，阳性细胞会更多。
19、维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度，本技术中所用的hek293t细胞培养的标准温度为36.5±0.5℃，将该细胞放入25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但相比于37℃条件下培养细胞增殖速度减缓，有利于延长细胞培养时间，增加mog蛋白的表达量。诱导剂可以促进细胞生长，提高细胞膜的延展性。例如egf为表皮细胞生长因子，可以促进人上皮细胞的生长，在转染含有mog基因的重组质粒后，配合加入表皮细胞生长因子egf，可以有效的促进细胞膜生长，使染色后细胞膜形态更为清晰。
20、在低温条件下培养48-72h，可以有效控制转染后的细胞密度，此时细胞膜上会有大量的mog蛋白表达，而在egf的诱导下，细胞膜得到很好的延展，经固定和染色后，在荧光显微镜下将会观察到明显的阳性细胞膜染色结果。
21、蛋白保护剂采用质量浓度为2-15%的糖类与摩尔浓度为0.1-1.0mmol/l的蛋白酶抑制剂配合使用，使得天然蛋白稳定性得到增强。例如，糖类可以是蔗糖和海藻糖，蛋白酶抑制剂可以是pmsf。
22、本技术中，蔗糖与海藻糖是蛋白质在干燥状态下最好的稳定剂，对阻止蛋白质二级结构改变起到显著作用，同时能够降低蛋白酶对目的蛋白的水解作用；pmsf可以抑制多种类型的蛋白酶，保护目标蛋白不受蛋白酶降解作用的影响。此外，加入蛋白保护剂后，还能避免抗mog抗体检测材料直接与空气接触，降低蛋白被氧化和微生物污染的风险，延长抗原蛋白的保存时长。
23、由于固定后的蛋白质易受到温湿度的影响而降解，为防止检测材料中的抗原失效，本技术对固定后的细胞爬片用蛋白保护剂进行处理。蛋白保护剂中的糖类物质可以有效地附着在抗原表面，起到保护作用，延长检测材料的保存期。本技术所配制的蛋白保护剂在pbs缓冲液中浸泡后即可去除，不影响后续检测材料的实验检测。
24、可选地，所述诱导剂为egf（表皮细胞生长因子）、tgf-α（转化生长因子α）、hbegf（肝素结合egf样生长因子）和epr（表皮调节素）中的任意一种或多种。
25、可选地，所述诱导剂的加入量为0.5-0.8ng/ml。
26、可选地，所述抗mog抗体检测材料的制备过程温度不高于35℃。
27、第三方面，本技术提供了一种抗mog抗体检测材料。该抗mog抗体检测材料利用上述制备方法制得。
28、可选地，利用所述检测材料对样本进行检测时，检测过程的温度不高于35℃。
29、可选地，检测过程均在常温下进行。
30、第四方面，本技术提供了一种上述抗mog抗体检测材料在制备用于对抗mog抗体进行检测的产品中的应用。
31、第五方面，本技术提供了一种cba检测试剂盒。该cba检测试剂盒包括上述抗mog抗体检测材料。
32、第六方面，本技术提供了一种利用上述抗mog抗体检测材料的cba检测方法，采用如下技术方案：
33、一种利用上述抗mog抗体检测材料的cba检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：
34、向所述抗mog抗体检测材料的反应孔内加入样本避光反应；后用缓冲液洗净，放入染缸中浸泡，结束后取出并弃尽反应孔中的液体；继续加入荧光二抗继续避光反应；后用缓冲液洗净，并加入封片介质，观察结果。
35、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
36、本技术通过预测mog蛋白序列的糖基化位点，进而对其序列进行突变，改变mog蛋白结构，降低细胞表达后的毒性效果，同时改善染色后的阳性细胞形态。
37、本技术的抗mog抗体检测材料的制备方法中，转染后的培养通过低温条件与诱导剂诱导相互配合。一方面，细胞在低温条件下生长速度缓慢，便于控制细胞密度；另一方面，加入诱导剂会促进细胞生长，配合低温培养条件，可以使细胞生长而不大量增殖，细胞膜表面积增大，有利于mog的过表达。
38、本技术对固定后的细胞爬片用蛋白保护剂进行处理。蛋白保护剂中的糖类物质可以有效地附着在抗原表面，起到保护作用，延长检测材料的保存期。本技术所配制的蛋白保护剂在pbs缓冲液中浸泡后即可去除，不影响后续的检测材料的实验检测。
1.一种编码mog的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括如seq id no：1所示的核苷酸序列。
2.一种抗mog抗体检测材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为egf、tgf-α、hbegf和epr中的任意一种或多种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂的加入量为0.5-0.8ng/ml。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述抗mog抗体检测材料的制备过程温度不高于35℃。
6.一种抗mog抗体检测材料，其特征在于，所述抗mog抗体检测材料利用权利要求1-5中任一项所述的制备方法制得。
7.根据权利要求6所述的抗mog抗体检测材料，其特征在于，利用所述检测材料对样本进行检测时，检测过程的温度不高于35℃；
8.一种权利要求6所述的抗mog抗体检测材料在制备用于对抗mog抗体进行检测的产品中的应用。
9.一种cba检测试剂盒，其特征在于，所述cba检测试剂盒包括权利要求6所述的抗mog抗体检测材料。
10.一种利用权利要求6所述的抗mog抗体检测材料的cba检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：向所述抗mog抗体检测材料的反应孔内加入样本避光反应；后用缓冲液洗净，放入染缸中浸泡，结束后取出并弃尽反应孔中的液体；继续加入荧光二抗继续避光反应；后用缓冲液洗净，并加入封片介质，观察结果。
