一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，具体地，涉及一种检测肿瘤驱动基因tp53r248w的试剂盒。
背景技术：2.tp53是非常重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达。该基因的错义突变、插入或缺失造成的失活突变非常常见。临床研究证实肿瘤中95.1％的tp53点突变主要发生在高度保守的175、245、248、249、273和282位点。tp53中的功能丧失事件在癌症中很常见，r248w变异体不仅导致肿瘤抑制的丧失，而且作为一种功能获得突变，可促进小鼠模型中的肿瘤发生。与野生型突变株相比，这种突变株对阿霉素治疗反应更灵敏。现已证明r248w突变会导致更差的生存率。对肿瘤驱动基因tp53 r248w的检测有助于临床上的用药指导和预后评估，对提高患者的总生存率具有重要意义。
3.目前，组织和血浆中的tp53 r248w的检测手段主要有数字pcr，高通量测序，突变扩增系统等。tp53基因r248w突变是基因742位碱基由c突变为t，由于只有单个碱基突变，如果使用qpcr技术检测会出现假阳性现象，这是因为qpcr所用探针存在固有缺点——容易与非靶目的基因非特异性结合，形成错配，特别是非靶基因与靶基因只存在一个碱基的差别。数字pcr技术成本高，对仪器和操作人员要求高；高通量测序灵敏度高但实验流程复杂；突变扩增系统操作简单但稳定性欠佳，所以亟需找寻一个新的灵敏度高、稳定性好及成本低的肿瘤驱动基因检测方法。
4.随着基因检测技术的不断发展，市场上出现了许多的基因检测项目，一大批新兴企业开始在这个领域争奇斗艳，如国外的ancestry、illumina、helix、23an dme，和国内的华大基因、圣湘生物、安我基因等等。目前国民生活质量正在提高，消费者的健康意识也逐渐增强，越来越多的人开始关注自身的身体健康以及营养情况等深层次需求，特别是作为消费主体的年经人，对于新鲜事物更易接受，对基因遗传等医学知识更加了解，乐于使用基因检测的手段了解自身遗传和身体健康信息，使得消费级基因检测市场不断增大。在未来的商业发展中，随着基因检测产业越来越成熟，下游的服务业务将迎来极大的扩展，基因检测企业所面临的竞争也将更加激烈，考验更加巨大。
技术实现要素：5.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒。
6.本发明的第一个目的是提供一种组合物。
7.本发明的第二个目的是提供所述组合物在制备检测肿瘤驱动基因tp53r248w产品中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
10.一种组合物，所述组合物包括crrna、引物和探针，所述crrna的核苷酸序列如seq id no：5所示。
11.优选地，所述引物的核苷酸序列如seq id no：2和seq id no：4所示。
12.优选地，所述探针的核苷酸序列如seq id no：6所示。
13.更优选地，所述探针的5’端标记fam基团，3’端标记bhq1基团。
14.所述组合物在制备检测肿瘤驱动基因tp53 r248w产品中的应用。
15.一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒，所述试剂盒中含有所述组合物。
16.优选地，所述试剂盒中含有raa或pcr扩增试剂，以及cripsr/cas13a检测试剂，所述raa或pcr扩增试剂含有所述引物，所述cripsr/cas13a检测试剂含有所述crrna和所述探针。
17.优选地，所述试剂盒中raa扩增试剂还包括raa反应液、mgcl2、水和raa干粉，所述raa干粉管含有重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶。
18.更优选地，所述试剂盒中raa扩增试剂还包括核苷酸序列如seq id no：2和seq id no：4所示的引物各1～4μl，各引物浓度10μm、raa反应液15～60μl、28mm的mgcl
2 1～5μl、水6.5～26μl和raa干粉50mg，所述raa干粉管含有重组酶25～100u、单链结合蛋白1～4mg和dna聚合酶50～200u。
19.更优选地，所述试剂盒中raa扩增试剂包括核苷酸序列如seq id no：2和seq id no：4所示的引物各2μl，各引物浓度10μm、raa反应液29.5μl、28mm的mgcl
2 2.5μl和、水13μl和raa干粉50mg，所述raa干粉管含有重组酶100u、单链结合蛋白2mg和dna聚合酶100u。
20.优选地，所述试剂盒中pcr扩增试剂还包括dna聚合酶和水。
21.更优选地，所述试剂盒中pcr扩增试剂还包括核苷酸序列如seq id no：2和seq id no：4所示的引物各1～4μl、dna聚合酶12.5～50μl和水10.5～42μl。
22.更优选地，所述试剂盒中pcr扩增试剂还包括dna聚合酶25μl和水20μl。
23.优选地，所述试剂盒中cripsr/cas13a检测试剂还包括所述扩增产物、所述crrna、cas13a蛋白、所述探针、t7转录酶、rna酶抑制剂、5
×
的t7 buffer、ntp和水。
24.更优选地，所述试剂盒中cripsr/cas13a检测试剂包括扩增产物1～2μl、1μm的crrna 0.5～1μl、10μm的cas13a蛋白0.5～1μl、10μm的探针0.5～1μl、50u/μl的t7转录酶0.5～1μl、rna酶抑制剂0.5～1μl、5
×
的t7 buffer2～8μl和ntp1～2μl，无rna酶纯水补足反应试剂至20μl。
25.更优选地，所述试剂盒中cripsr/cas13a检测试剂包括扩增产物2μl、1μm的crrna1μl、10μm的cas13a蛋白1μl、10μm的ssrna荧光报告基因1μl、50u/μl的t7转录酶1μl、rna酶抑制剂1μl、5
×
的t7 buffer 4μl和ntp 2μl，无rna酶纯水补足反应试剂至20μl。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明提供一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒，用核苷酸序列如seq id no：5所示的crrna，将r248w突变碱基设计在crrna的间隔序列的5’末端，并引入新的错配碱基c，当crrna的间隔序列与野生型rna之间有两个碱基错配，将不会形成复合物，不能激活cas13a蛋白。本发明的试剂盒最低可以检测出突变频率为0.01％的混合质粒，最低能检测出血浆中浓度为104copies/μl的tp53 r248w变异体。本发明的试剂盒，具有良好的灵敏度，特异性高，操作简便，快速高效；用于检测肿瘤患者血浆中的tp53 r248w突变情况，为临床
诊断和治疗提供分子学依据。
28.crispr/cas13a核酸检测体系中采用raa方法作为核酸扩增技术，raa技术是一种体外核酸等温扩增检测技术，既可以检测dna，也可以检测rna，与pcr技术相比，具有成本低、耗时短、操作简单、不受检测场地限制等优点。与其他核酸检测方法相比，crispr/cas13a检测方法提供了一种更为快速的替代方案，并通过荧光读数提供一个可视化的读取结果，类似于在家庭使用的妊娠检测，实验人员仅需使用便携式的加热器和现成的试剂，以及小型的荧光检测仪，就能进行肺癌驱动基因tp53 r248w的检测，在可视化读出条上读取结果。
附图说明
29.图1为primer1和primer2扩增产物的电泳结果及crispr/cas13a检测结果。其中a为primer1和primer2扩增产物(raa和pcr)琼脂糖凝胶电泳图；b为primer1和primer2扩增产物的crispr/cas13a检测结果；c为crispr/cas13a检测结果统计学分析；图中ns意为无统计学意义，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
30.图2为不同浓度crrna对crispr/cas13a检测强度的影响，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
31.图3为t7buffer对cripsr/cas13a检测效果的影响，其中a为添加t7 buffer，b为未添加t7 buffer。
32.图4为crispr/lwacas13a对不同突变频率tp53 r248w的检测，其中a为扩增产物的电泳图；b为crispr/cas13a方法对不同tp53 r248w突变频率的检测结果。*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
33.图5为crispr/cas13a对模拟血浆ctdna的检测。其中a为血浆ctdna的扩增产物的电泳图；b为crispr/cas13a方法对模拟血浆ctdna的检测结果。*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
具体实施方式
34.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
35.实施例1扩增tp53 r248w变异体的方法对cripsr/cas13a检测效果的影响
36.一、实验方法
37.1、扩增tp53 r248w变异体
38.根据tp53 r248w变异体序列设计两对扩增引物primer 1和primer 2，primer 1包含核苷酸序列如seq id no：2(前引物)和seq id no：3所示的引物(后引物)，primer 2包含核苷酸序列如seq id no：2(前引物)和seq id no：4(后引物)所示的引物。引物primer 1用于扩增出核苷酸序列如seq id no：7所示的扩增产物，引物primer 2用于扩增出核苷酸序列如seq id no：8所示的扩增产物。
39.raa的扩增体系如下：tp53 r248w质粒1μl，前、后引物各2μl，10μm，raa反应液29.5
μl，mgcl2(28mm)2.5μl，纯水13μl。将上述试剂充分混匀后，加入50mgraa干粉(含有重组酶100u、单链结合蛋白2mg、dna聚合酶100u)中，然后39℃孵育20min。tp53 r248w质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示。
40.pcr检测体系如下：
41.tp53 r248w质粒1μl，前、后引物各2μl，10μm，dna聚合酶(dna polymerase(r045a,takara))25μl，纯水20μl。将上述试剂充分混匀后，进入扩增程序。tp53 r248w质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示。
42.pcr的扩增程序如下：98℃预热5min，然后98℃10s，58℃15s，72℃30s，循环40次，最后72℃孵育10min。
43.引物和crrna、rna探针序列如表1所示：
44.表1引物和crrna、和探针核苷酸序列
[0045][0046]
2、cripsr/cas13a方法分别检测步骤1核苷酸序列如seq id no：7和seq id no：8所示的扩增产物，检测体系如下：
[0047]
步骤1扩增的核苷酸序列如seq id no：7所示的扩增产物或核苷酸序列如seq id no：8所示的扩增产物2μl、1μm的r248w-crrna1μl，10μm的cas13a蛋白1μl，10μm的探针(probe)1μl，t7转录酶(50u/μl)1μl，rna酶抑制剂1μl，5
×
的t7 buffer 4μl，ntp 2μl，无rna酶纯水补足反应体系至20μl。
[0048]
检测体系混匀后，用bio rad cfx荧光检测仪，37℃检测1h，记录各时间段的相对荧光值(relative fluorescence unit,rfu)。
[0049]
二、实验结果
[0050]
pcr和raa技术均成功扩增出约110bp的片段(seq no id：7)和360bp片段(seq no id：8)(图1a)。使用crispr/cas13a检测扩增产物，结果表明在10min内，各组rfu值均达到平台期，但基于primer 1扩增的r248w变异体的rfu值与野生型相比无显著性差异(p》0.05)；而基于primer 2扩增的r248w变异体的rfu值显著高于野生型(p《0.001)(图1b、c)。
[0051]
tp53基因r248w突变是基因742位碱基由c突变为t，具体地，tp53基因r248w基因中与crrna间隔互补的一段序列中，野生型序列的核苷酸序列为突变型序列的核苷酸序列为序列为突变株是由野
生株的c突变为t，具体可见表粗和有下划线的碱基。由于只有单个碱基突变，使用qpcr技术检测会出现假阳性现象，因为qpcr所用探针存在固有缺点-容易与非靶目的基因非特异性结合，形成错配，特别是非靶基因与靶基因只存在一个碱基的差别。
[0052]
crispr/cas13a检测技术中cas13a蛋白是技术中的效应蛋白，只有crrna与靶目的基因匹配才能被激活产生“连带剪切”rna酶特性，如果crrna错配其他基因，cas13a蛋白将不能行使功能，crispr/cas13a检测技术降低了假阳性结果的发生。扩增产物必须包含突变位点，因此前后引物必须在突变位点的两端。如果扩增片段过低，如110bp，r248w-crrna与靶基因(即扩增片段)的复合物不能使cas13a产生“连带剪切”功能，而在360bp左右，r248w-crrna与靶基因(即扩增片段)的复合物能够激活cas13a。
[0053]
将r248w突变碱基设计在crrna的间隔序列的5’末端，并引入新的错配碱基c，当crrna的间隔序列与野生型rna之间有两个碱基错配，将不会形成复合物，不能激活cas13a蛋白。
[0054]
实施例2 r248w-crrna浓度对cripsr/cas13a检测效果的影响
[0055]
一、实验方法
[0056]
将r248w-crrna梯度稀释成5个浓度，使cripsr/cas13a检测反应体系的crrna终浓度分别为0.05μm、0.1μm、0.15μm、0.20μm和0.25μm。cripsr/cas13a检测反应体系同实施例1。
[0057]
二、实验结果
[0058]
结果表明，在0.05～0.25μm范围内，随着r248w-crrna浓度的增加，rfu值也随之增大，其中r248w-crrna浓度达到0.20μm及以上时，差异具有统计学意义(p《0.001)，表明r248w-crrna浓度的提高会增强crispr/cas13a的荧光信号强度(图2)，r248w-crrna的浓度选择0.25μm。
[0059]
实施例3 t7 buffer对cripsr/cas13a检测效果的影响
[0060]
一、实验方法
[0061]
cripsr/cas13a检测方法同实施例1，扩增引物核苷酸序列如seq no id：2和seq no id：4所示，比较添加或不添加t7 buffer(北京全式金生物公司(jt101-01))对cripsr/cas13a检测效果的影响。
[0062]
二、实验结果
[0063]
由于t7转录酶受钠、镁离子的影响大，t7转录酶只有在下合适的钠、镁离子浓度才能工作，但由于扩增产物，cas13a蛋白保存液里的钠、镁离子浓度难以稳定，造成检测体系中t7转录酶功能有时未能发挥。结果如图3所示，表明检测反应体系中需要加入t7 buffer，以激发t7转录酶的转录作用，且t7 buffer的加入不影响crispr/cas13a系统对突变株的检测效能。
[0064]
实施例4一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒
[0065]
一、组成
[0066]
1、raa的扩增体系：前、后引物各2μl，10μm，raa反应液29.5μl，mgcl2(28mm)2.5μl，纯水13μl。50mgraa干粉(含有重组酶100u、单链结合蛋白2mg、dna聚合酶100u)。前引物核苷酸序列如seq id no：2所示，后引物核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0067]
2、pcr检测体系：前、后引物各2μl，10μm，dna聚合酶(dnapolymerase(r045a,
takara))25μl，纯水20μl。前引物核苷酸序列如seq id no：2所示，后引物核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0068]
3、cripsr/cas13a检测体系：
[0069]
raa或pcr的扩增体系扩增的产物2μl、1μm的r248w-crrna1μl，10μm的cas13a蛋白1μl，10μm的探针(probe)1μl，t7转录酶(50u/μl)1μl，rna酶抑制剂1μl，5
×
的t7 buffer 4μl，ntp 2μl，无rna酶纯水补足反应体系至20μl。r248w-crrna的核苷酸序列如seq id no：5所示，探针(probe)的核苷酸序列如seq id no：6所示，同时，探针(probe)的5’端标记有fam基团，3’端标记有bhq1基团。
[0070]
二、使用方法
[0071]
1、充分混匀raa的扩增体系，加入待测dna片段1～2μl，39℃孵育20min。
[0072]
2、充分混匀pcr的扩增体系，加入待测dna片段1～2μl，进入扩增程序。pcr的扩增程序如下：98℃预热5min，然后98℃10s，58℃15s，72℃30s，循环40次，最后72℃孵育10min。
[0073]
3、cripsr/cas13a检测体系混匀后，用bio rad cfx荧光检测仪，37℃检测1h，记录各时间段的相对荧光值(relative fluorescence unit,rfu)，当rfu值大于对照组1倍判定为阳性。
[0074]
实施例5对不同突变率tp53 r248w的检测效果
[0075]
一、实验方法
[0076]
将浓度为103、104、105和106拷贝数(copies)/μl的tp53 r248w质粒分别与107copies/μl的tp53野生株按体积比1：1混合，形成突变频率为0.01％、0.1％、1％和10％的混合质粒，分别取2μl不同突变率的混合质粒进行pcr扩增，然后用实施例4的试剂盒进行检测。
[0077]
二、实验结果
[0078]
以混合质粒为模板，通过pcr技术，成功扩增出含突变位点的序列片段(图4a)。使用crispr/cas13a方法检测扩增产物，结果显示，不同突变频率的tp53基因的检测结果与野生型相比，差异具有统计学意义(p《0.05)，最低可以检测出突变频率为0.01％的混合质粒(含有103copies的变异体)，表明tp53基因野生型的存在不影响tp53 r248w变异体的检出(图4b)。
[0079]
实施例6对血浆游离dna的检测
[0080]
一、实验方法
[0081]
采用magen的核酸提取试剂盒，试剂盒货号为d3182-03，按说明书指导提取血浆游离dna。具体步骤如下：
[0082]
1、转移100μl蛋白酶k至10～50ml离心管中。
[0083]
2、转移1ml血清至步骤1装有蛋白酶k离心管中，混匀5s，得到血清和蛋白酶k混合样品。
[0084]
3、carrier rna与消化液acl预先混匀，加入0.8ml消化液acl/carrier rna(1μg)至步骤2血清和蛋白酶k混合样品中，每个样品中carrier rna的用量为1μg(5μl)，涡旋混匀10s。60℃水浴30min，其间偶尔颠倒数次混匀。
[0085]
4、再加入1.8ml结合液acb2至样品中，颠倒混匀10～15次，冰上放置5min，得到混合液。
[0086]
5、把游离核酸吸附柱和真空接头连接到真空抽滤盒中，把延长管插到游离核酸吸附柱子中。
[0087]
6、把步骤4获得的混合液(一次不超过15ml)转移至步骤5的柱子中并打开真空泵进行抽滤，继续把混合液转移至柱子进行抽滤。抽滤完毕后，关闭真空泵，让压力下降为零。弃去延长管。
[0088]
7、加入850μl洗涤液dcw1至柱子中，抽滤完毕后，关闭真空泵，让压力下降为零。
[0089]
8、步骤7抽滤完毕后，再加入850μl洗涤液dcw2至柱子中，抽滤完毕后，关闭真空泵，让压力下降为零，收集洗脱液。
[0090]
9、收集步骤8的洗脱液，加入850μl无水乙醇至柱子中，抽滤完毕后，关闭真空泵，让压力下降为零。
[0091]
10、取下柱子，装在收集管中。13000
×
g离心3min，取出柱子，装在1.5ml新的收集管中，56℃烘箱中干燥10min。
[0092]
11、加入40～60μl洗脱液ae至柱子的膜中央，放置3min，13000
×
g离心1min，收集洗脱液。
[0093]
12、把步骤11收集的洗脱液转移至柱子的膜中央，放置1min，13000
×
g离心1min。
[0094]
13、丢弃dna结合柱，把含有dna的洗脱液保存于-20℃或-80℃。
[0095]
然后用实施例4的试剂盒，对血浆游离dna进行检测。
[0096]
二、实验结果
[0097]
以模拟血浆ctdna为模板，成功扩增出含突变位点的序列片段(图5a)。使用实施例1的crispr/cas13a方法检测扩增产物，结果显示，当血浆中的tp53r248w变异体浓度达到104copies/μl，其rfu值明显高于野生型血浆，差异具有统计学意义(p《0.01)，表明本研究方法最低能检测出模拟血浆中浓度为104copies/μl的tp53 r248w变异体(图5b)。
[0098]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
技术特征：1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括crrna、引物和探针，所述crrna的核苷酸序列如seq id no：5所示。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no：2和seq id no：4所示。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如seq id no：6所示。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记fam基团，3’端标记bhq1基团。5.权利要求1～4任一所述组合物在制备检测肿瘤驱动基因tp53 r248w产品中的应用。6.一种检测肿瘤驱动基因tp53 r248w的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～4任一所述组合物。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有raa或pcr扩增试剂，以及cripsr/cas13a检测试剂，所述raa或pcr扩增试剂含有权利要求2中所述引物，所述cripsr/cas13a检测试剂含有权利要求1中所述crrna和权利要求3中所述探针。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中raa扩增试剂还包括raa反应液、mgcl2、水和raa干粉，所述raa干粉含有重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中pcr扩增试剂还包括dna聚合酶和水。10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中cripsr/cas13a检测试剂还包括权利要求8或9中所述扩增试剂的扩增产物、权利要求1中所述crrna、cas13a蛋白、权利要求3中所述探针、t7转录酶、rna酶抑制剂、5
×
的t7 buffer、ntp和水。
技术总结本发明提供一种检测肿瘤驱动基因TP53R248W的试剂盒，用核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的crRNA，将R248W突变碱基设计在crRNA的间隔序列的5’末端，并引入新的错配碱基C，当crRNA的间隔序列与野生型RNA之间有两个碱基错配，将不会形成复合物，不能激活Cas13a蛋白。本发明的试剂盒最低可以检测出突变频率为0.01％的混合质粒，最低能检测出血浆中浓度为104copies/μL的TP53R248W变异体。本发明的试剂盒，具有良好的灵敏度，特异性高，操作简便，快速高效。快速高效。快速高效。
技术研发人员：李林海 邝振展 陈建芸 孙朝晖 肖斌 陈丽莎
受保护的技术使用者：中国人民解放军南部战区总医院
技术研发日：2022.06.24
技术公布日：2022/11/1
