的ynlf_31c、ynlf_34c、btky72、bm48-31、16bo133、hku3、rm1和 rf1等，以及sars-cov-2支系的rmyn02之rbd则应无法与ace2结合，而 是使用其他蛋白作为感染的受体，这些病毒株的rbd大多具有两段序列缺失， 可能因此影响和ace2结合的能力。sarsr-cov中，与ace2的结合能力应为 多次起源，有学者提出sars-cov-2支系病毒的共祖可能可和ace2结合 (rmyn02则是后来才丧失了此能力)，后来某个sars-cov-2支系的病毒曾 和sars-cov支系的病毒发生重组，造成部分sars-cov支系的病毒也获得了 和ace2结合的能力。
5.同时，由于各种冠状病毒的变异株(目前已知sars-cov-2有alpha、beta、 gamma、delta、lambda和omicron等)层出不穷，这为研发相关药物设置了障 碍，有些在动物实验中测试有效的药物针对人体却出现无效甚至毒副作用的情 形。因此，如何建立快速检测和药物筛选的人体细胞平台，是亟待解决的关键 问题。
6.人体干细胞及其分化的细胞在再生医学、疾病机制研究、治疗策略和药物 筛选方面具有极其重要的前景。传统的胚胎干细胞来源于胚胎发育到100多个 细胞时的早期胚胎，一般不具有胚外发育的能力。而近年来报道的扩展潜能干 细胞(epsc)、原始胚胎干细胞(naive esc)以及8细胞样全能干细胞 (8clc)等，可发展成胚内三胚层和胚外滋养层等多种类型的组织细胞，由 于其能够向胚外谱系分化，因此可诱导分化为滋养层干细胞(trophoblast stemcell,tsc)或滋养层前体细胞(trophoblast progenitor cell)。一些胎盘组织中 也相继分离和建立滋养层干细胞(tsc)或滋养层前体细胞。这些人源的极早 期胚胎干细胞和胚外滋养层干细胞在新冠病毒研究中的作用等，还缺乏深入的 研究。
技术实现要素：7.基于上述技术背景，本发明所要解决的技术问题在于，提供一种人源细胞 模型在病毒制备、检测和药物筛选中的应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人源胚外滋养层细胞模型在病 毒制备中的应用。
9.本发明还提供了人源胚外滋养层细胞模型在制备预防病毒的疫苗中的应用。
10.本发明还提供了人源胚外滋养层细胞模型在检测病毒中的应用。
11.本发明还提供了人源胚外滋养层细胞模型在制备和/或筛选病毒疾病治疗药 物中的应用。
12.所述人源胚外滋养层细胞模型由人体胚外早期细胞诱导分化而得；
13.所述人体胚外早期细胞主要包括人滋养层干细胞或人滋养层前体细胞，或 可形成上述细胞的各类人源干细胞或人体早期胚胎组织分离的细胞等。
14.具体的，所述人源干细胞为各类人源早期干细胞、人源早期干细胞经基因 编辑或组织工程改造的细胞亚系、体细胞重编程诱导的早期干细胞及其基因编 辑或工程改造细胞亚系；
15.人体早期胚胎组织分离的细胞指人源胎盘组织分离的细胞、人源胎盘组织 分离的细胞经基因编辑或组织工程改造的细胞亚系。
16.优选的，所述人源干细胞为人源扩展潜能干细胞、胚胎干细胞等能够 诱导为人源滋养层干细胞或滋养层前体细胞的干细胞，和/或上述细胞经基因编 辑或组织工程改造优化的细胞亚系。
17.具体的，本发明中的病毒为以ace2为受体介导入胞的病毒，和/或以 dpp4为受体介导入胞的病毒。
18.优选的，本发明中的病毒为冠状病毒属的各类病毒及其变异株，示例性的 如sars-cov病毒及其变异株、mers-cov病毒及其变异株、hcov-229e病 毒及其变异株、hcov-oc43病毒及其变异株、hcov-nl63病毒及其变异株、 hcov-hku1病毒及其变异株、以及今后可能出现的以sars-cov主要受体 ace2为受体介导入胞的各类病毒，或mers-cov受体dpp4为受体介导入胞 的各类病毒。但不限于此。
19.示例性的，sars-cov-2病毒的变异株包括alpha、beta、gamma、delta、 lambda和omicron，但不限于此。
20.具体的，在本发明的一个实施例中，所述人源细胞模型为滋养层干细胞模 型、合胞体滋养层细胞模型(包括早期合胞体滋养层细胞模型和成熟合胞体滋 养层细胞模型)、绒毛外滋养层细胞模型、胎盘类器官模型中的一种或多种， 但不限于此。
21.其中，早期合胞体滋养层细胞满足(1)～(4)中任一个或多个条件的细 胞：
22.(1)处于胚外分化早期的，高表达ace2的细胞；
23.(2)处于胚外分化早期的，单核或双核的细胞；
24.(3)处于胚外分化早期的，高表达cd46和/或ssea4的细胞；
25.(4)处于胚外分化早期的，不表达或低表达cgb，和/或不(低)分泌β
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hcg的细胞。
26.进一步的，早期合胞体滋养层细胞不应该具有(a)～(c)中任一个或多 个条件的细胞：
27.(a)处于胚外分化中期或后期的，多核融合的细胞；
28.(b)处于胚外分化中期或后期的，高表达cgb，或高分泌β-hcg的细胞
29.(c)处于胚外分化中期或后期的，不表达或低表达ace2的细胞。
30.需要说明的是，本技术定义的早期合胞体滋养层，其以是否满足上述条件 的细胞为要件，而不以胚外分化的时间为要件。
31.优选的，当将人源胚外滋养层细胞模型应用于病毒制备时，所述人源胚外 滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型；所述早期合胞体滋养层细胞模 型作为高效复制、扩增和生产病毒的工具细胞。
32.具体的，在本发明的一个实施例中，病毒的制备方法包括：
33.(1)制备早期合胞体滋养层细胞；
34.(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞；
35.(3)收集细胞上清液和细胞裂解液，进行病毒的提取和纯化。
36.优选的，当将人源胚外滋养层细胞模型应用于制备预防病毒的疫苗时，所 述人源胚外滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型，所述早期合胞体滋 养层细胞模型所复制或扩增生产的病毒进行疫苗的生产。
37.具体的，在本发明的一个实施例中，疫苗的制备方法包括以下步骤：
38.(1)制备早期合胞体滋养层细胞；
39.(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞，病毒扩增和收集、纯化。
40.(3)利用步骤(2)处理后的病毒，制得疫苗。
41.进一步的，疫苗的制备方法还包括按照现有不同疫苗的研发策略进行不同 类别
的疫苗的制备。具体的，所述疫苗包括灭活疫苗、减活疫苗、腺病毒载体 疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗，但不限于此。示例性的，在本发明的一个实 施例之中，可将早期合胞体滋养层细胞复制得到的病毒进行灭活，然后与辅料 混合，即得到灭活疫苗。在本发明的另一个实施例中，可将早期合胞体滋养层 细胞复制得到的病毒提取mrna，用以制备mrna疫苗。
42.优选的，当将人源合胞体滋养层细胞模型应用于病毒检测时，所述人源胚 外滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型。
43.具体的，在本发明的一个实施例之中，病毒检测方法包括：
44.(1)制备早期合胞体滋养层细胞；
45.(2)采用待检测样品感染早期合胞体滋养层细胞；
46.(3)收集细胞上清液和细胞裂解液，进行病毒检测和鉴定。
47.优选的，当将人源合胞体滋养层细胞模型应用于病毒检测时，所述人源细 胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型；
48.优选的，当将人源合胞体滋养层细胞模型应用于制备和/或筛选治疗病毒的 药物时，所述冠状病毒疾病包括由冠状病毒及其变异株引起的疾病、冠状病毒 或其变异株与其他病毒疾病合并感染的疾病；
49.所述应用包括利用合胞体滋养层细胞模型对已有药物和/或未知药物的筛选、 测试和鉴定。
50.优选的，所述的筛选包括利用早期合胞体滋养层细胞模型进行的各种药理 学、毒理学和安全性实验，包括但不限于筛选、测试和鉴定药物浓度剂量的有 效性、药物敏感性人群、检测药物毒性、药物的致癌和致畸作用等。
51.具体的，在本发明的一个实施例之中，抗病毒药物检测和筛选的方法为：
52.(1)制备早期合胞体滋养层细胞；
53.(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞；
54.(3)抗病毒药物以不同剂量施加于感染病毒后的早期合胞体滋养层细胞， 检测细胞生长活力，测定病毒载量，确定药物抑制病毒的效应。
55.优选的，所述合胞体滋养层细胞模型的制备方法为：
56.(1)提供/制备人体胚外早期细胞；
57.(2)将所述人体细胞分化诱导筛选得到人早期合胞体滋养层细胞；
58.(3)鉴定、制备和扩增早期合胞体滋养层细胞模型。
59.更佳的，所述合胞体滋养层细胞模型的制备方法为：
60.(1)提供/制备人源干细胞或人体早期胚胎组织分离的细胞；
61.(2)将所述人源干细胞或人体早期胎盘组织分离的细胞消化分离成单细 胞；再将单细胞接种至细胞基质胶包被的培养板中，并培养预设时间，其中， 培养板中含有人源滋养层干细胞培养基；
62.然后挑取培养产生的单克隆消化为单细胞，重新接种至基质胶包被的培养 板中，再经人源滋养层干细胞培养基培养，反复传代4～5代，经鉴定标志物后 确定得到纯的人滋养层干细胞或滋养层前体细胞；
63.(3)将人滋养层干细胞或滋养层前体细胞接种至合胞体滋养层细胞培养 基中，培养预设时间，经标志物鉴定后得到早期合胞体滋养层细胞。
64.具体的，在本发明的一个可选的实施例中，早期合胞体滋养层细胞模型的制备方法为：
65.(1)将人胚胎干细胞转化为人扩展潜能干细胞；
66.(2)将所述人扩展潜能干细胞接种至人滋养层干细胞培养基中培养、传代，得到人滋养层干细胞；其中，所述人滋养层干细胞培养基包括第一主培养基和第一辅料，所述第一辅料包括以下组分：β-硫基乙醇30～100μmol/l，胎牛血清0.1～0.5wt％，青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液0.2～1wt％，牛血清白蛋白0.1～0.5wt％，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂0.5～2wt％，维生素c30～100μg/ml，表皮生长因子10～100ng/ml，chir990211～5μmol/l，a83-010.1～1μmol/l，sb4315420.5～3μmol/l，丙戊酸8～12μmol/l，y276323～10μmol/l；
67.具体的，步骤(2)包括：
68.(2.1)将人扩展潜能干细胞分离成单细胞；
69.(2.2)将单细胞接种至细胞基质胶包被的培养板中，并培养12～14天；其中，每孔接种量为1000～3000个细胞，每孔含有人滋养层干细胞培养基1-3ml；
70.(2.3)将培养产物消化为单细胞，重新接种至细胞基质胶包被的培养板中，传代4～5代，即得人滋养层干细胞；
71.其中，所述第一主培养基选用dmem培养基或dmem/f-12培养基。
72.(3)将人滋养层干细胞接种至合胞体滋养层细胞培养基中培养预设时间，即得到合胞体滋养层细胞；其中，所述合胞体滋养层培养基包括第二主培养基和第二辅料，所述第二辅料包括以下组分：β-硫基乙醇30～100μmol/l，青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液0.3～1wt％，牛血清白蛋白0.1～0.5wt％，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂0.5～3wt％，y276321～5μmol/l，毛喉素0.5～3μmol/l，血清替代物3～10wt％；
73.具体的，步骤(3)包括：
74.(3.1)将培养板采用细胞基质胶包被，其中，包被时间≥1h；
75.(3.2)将人滋养层干细胞接种至步骤(3.1)得到的培养板中，培养1～10天，即得到合胞体滋养层细胞；其中，每孔接种量为8万～14万个细胞，每孔含有合胞体滋养层细胞培养基1～3ml；
76.其中，所述第二主培养基选用dmem培养基或dmem/f-12培养基。
77.实施本发明，具有如下有益效果：
78.1，申请人通过实验意外的发现，人源胚外早期细胞分化得到的人源胚外滋养层干细胞或滋养层前体细胞对以ace2或dpp4为受体的病毒高度易感。据此，本发明提出了人源胚外滋养层细胞模型在以ace2或dpp4为受体的病毒高效制备、检测和药物筛选中的应用。
79.2，本发明基于人体胚外早期细胞，通过特定的诱导分化，分别得到了合胞体滋养层细胞(stb)模型、绒毛外滋养层细胞(evt)模型和类器官模型。并通过对以上三者感染模式和机制的研究，发现早期合胞体滋养层细胞(earlystb，即estb)模型高度易感于以ace2或dpp4为受体的病毒。这表明早期合胞体滋养层细胞可高效感染冠状病毒，因此可以作为以ace2或dpp4为受体的病毒的高效制备的工具细胞；尤其是，其采用人体来源的细胞制备而得，较现在用于病毒生产的vero细胞(来源于绿猴)具有与人体细胞更相近的细胞内病
毒复制、包装等原件，因此，所制备出的病毒在后续应用时(包括制备各 种疫苗)更加具有优势。
80.3，申请人还利用这种早期合胞体滋养层细胞模型进行了以ace2或dpp4 为受体的病毒的疾病所使用的治疗药物的测试，发现了有效的量效关系。同时 发现，早期合胞体滋养层细胞对抗病毒药物极其敏感，因此，在应用上，可以 作为抗病毒药物在人体细胞进行检测、筛选和鉴定的良好工具。
81.4，申请人还进行了stb、evt模型感染模式的对比，发现了estb高度 易感于以ace2或dpp4为受体的病毒，而evt和类器官模型等不易感染病毒 的模式为理解人类早期胚胎发育与病毒的关系提供了多种细胞模型。
82.5，本发明的各种细胞模型可以经多种可进行胚外分化的人源干细胞、滋 养层干细胞或胎盘组织细胞经过诱导分化而来，也包括经基因编辑或组织工程 改造的上述细胞，通过单细胞转录组数据分析进行了充分的分析和验证，不仅 证实了上述结论，也为极早期干细胞/胎盘早期细胞的转化应用提供了重要的转 化前景。
附图说明
83.图1是hepscs诱导建立滋养层干细胞和诱导分化滋养层细胞亚型实验图； 其中：
84.a为从人扩展潜能干细胞(hepscs)诱导分化依次产生人滋养层干细胞 (epsc-tscs)、合胞体滋养层细胞(stbs)和绒毛外滋养层细胞(evts)的实验流 程图。
85.b为人扩展潜能干细胞(hepscs)和诱导的人滋养层干细胞(epsc-tscs)形 态图。
86.c为免疫荧光染色检测epsc-tscs与bst-tsc(人囊胚建立的htscs细 胞)cdx2及htsc标志蛋白krt7、gata3、tead4、tfap2c、tp63和 ck18的表达。
87.d为转录组分析人滋养层细胞标志基因和推测的羊膜细胞标志基因在epsc-tscs、bst-tsc、ct-tscs(okae et al.,2018)和5株人胎盘来源的ct
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tscs(ct27,29,30,bts5 and bts11-tscs)(sheridan,m.a.,2021)上的表达水平， 可见所有的滋养层干细胞高表达滋养层细胞基因而低表达羊膜细胞基因。
88.e散点图显示不同来源的人滋养层干细胞中滋养层细胞和推测的羊膜细胞 标记基因的评分。gsva用于计算基因表达评分。
89.f所示为epsc-tsc向stbs诱导分化第6天(stb-d6)的形态图。
90.g为在epsc-tsc向stbs分化过程中，rt-qpcr检测tp63、cgb5、 gcm1和cgb3的表达水平图；其中，stb-d2、stb-d4和stb-d6分别是指 epsc-tsc向stb诱导分化的第2、4、6天。
91.h为epsc-tsc诱导分化第6天的stbs(stb-d6)，免疫荧光检测stb标 志蛋白(cgb、gcm1、gata3)的染色图；成熟的stb呈现融合的多核合胞 体样形态，高表达cgb，低表达gata3。
92.i为epsc-tsc向evt分化第8天产生evt(epsc-evt)的形态图；
93.j为免疫荧光染色检测epsc-tsc向evt分化第8天产生的evt中krt7 和hla-g(evt特异性标志蛋白)的表达图。
94.k为rt-qpcr检测epsc-tsc向evt分化中gata3、itga1、mmp2、 hla-g标志分子表达水平的的结果图；其中，evt-d2、evt-d4和evt-d6是 指epsc-tsc向evt分化的第4、6、8天。
95.l为流式细胞术定量分析epsc-tsc向evt分化第8天产生的evt中， 表达hla-g和
hla-a,b,c细胞表面蛋白的比例。
96.m为细胞侵袭实验评价epsc-tscs诱导分化的evts(分化第8天的evt 细胞)的侵袭能力图。
97.图2为hepscs诱导的滋养层细胞与人围植入期胚胎和早中期胎盘细胞的 比较分析图；其中：
98.a-b为体外培养的围植入期胚胎(上图)和妊娠早期中期的胎盘(下图) 的单细胞转录组分析的umap图；细胞发育阶段用不同的颜色标识出来。umap 图中，ed6-14是胚胎发育第6-14天，he8w/he24w分别是指与妊娠早(8周)/ 中期(24周)对应的胎盘滋养层细胞(a)以及滋养层细胞不同阶段类型(b)。 其中，pi是围植入期，pi-tb是围植入期-滋养层细胞，pi-stb是围植入期-合 胞体滋养层细胞，pi-evt是围植入期-绒毛外滋养层细胞，t1-ct是妊娠早期
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细胞滋养层、t1-stb是妊娠早期-合胞体滋养层细胞、t1-evt是妊娠早期-绒 毛外滋养层细胞，t2-evt是妊娠中期-绒毛外滋养层细胞。
99.c为体外诱导得到的滋养层细胞(包括epsc-tscs、bst-tsc和ct-tsc 及其分化的stb和evt细胞)的转录组与图b中细胞比较分析图；体外诱导 得到的滋养层细胞用浅蓝色圈标识。
100.d为单细胞转录组分析围植入期和胎盘组织的滋养层细胞ace2的表达图； 一些pi-stb即围植入期-合胞体滋养层细胞高表达ace2。
101.e中左侧小提琴图是人围植入期胚胎和胎盘组织不同阶段不同谱系ace2 和tmprss2的表达水平；右侧圆圈图是不同阶段、不同谱系的ace2阳性细 胞中ace2和tmprss2表达水平；其中，不同颜色的点表示出每类别细胞中 不同表达水平的平均值；不同大小的点代表了每类ace2阳性细胞中ace2或 tmprss2阳性细胞数目的比例。只有pi-stb即围植入期-合胞体滋养层细胞同 时高表达ace2和tmprss2。
102.f是epsc-stb、bst-stb、ct-stb中ace2和tmprss2转录信号图。 最下部图显示ace2和tmprss2位点的基因组区域，每条竖线代表一个外显 子，转录从右侧向左侧进行。
103.图3早期合胞体滋养层细胞estb高度易感sars-cov-2的试验结果图； 其中：
104.a为sars-cov-2感染实验流程图：具体的感染方法为：细胞与sars
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cov-2以感染复数0.1moi共孵育2小时，pbs洗脱，再用新鲜的细胞培养基培 养24、48或72小时；分别收集细胞培养上清液和细胞裂解物用于病毒基因组 检测和病毒蛋白分析。实验重复3次以上。
105.b为hepscs和epsc-tscs分别与病毒共孵育后在不同时间点搜集细胞上 清液，rt-qpcr定量检测每毫升上清液中sars-cov-2病毒基因组拷贝数。
106.c为在sars-cov-2孵育epsc-tscs 24hr后，免疫荧光共聚焦检测sars
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cov-2的n蛋白染色图；右图为阳性细胞比例。n＝36指随机抽取36个免疫荧 光视野用于统计。
107.d为在sars-cov-2孵育48小时后，免疫荧光检测epsc-tscs的krt7、ace2和sars-cov-2n蛋白。只有ace2阳性表达的细胞被病毒感染。
108.e为epsc-tscs被病毒孵育24小时后，sars-cov-2n蛋白和enpep免 疫荧光染色的典型图片。
109.f柱状图显示在hepsc、epsc-tsc及其分化的stb以及evt中，ace2 和tmprss2在不同时间点的表达水平。
110.g为在epsc-tscs及其向stbs分化过程中免疫印迹(wb)检测ace2蛋白 表达；可见
qpcr检测病毒拷贝和ace2基因表达水平。
128.e为stb-d3和stb-d4感染sars-cov-2病毒后的差异基因表达火山图。 显著上调或下调的基因分别用红色和蓝色表示，水平线指以0.05为基准p值， 垂直的虚线表示差异倍数大于1.5倍的基因。
129.f是sars-cov-2病毒感染前后的转座子(te)的转录组分析。未见差异表 达的转座子用灰色表示。
130.g在stb-d3、stb-d4和空白对照组中比较herv-w转录信号表达水平。
131.h左侧为伪时间轨迹分析pi-tb到pi-stb的发育路径；暗紫色表示分化早 期pi-tb，浅黄色代表pi-stb的分化。
132.右侧为用机器学习方法预测的pi-tb到pi-stb亚群的伪时间路径。x轴是 预测的伪时间，y轴是使用scanpy计算的观测的伪时间；灰色虚线箭头表示 了在预测的伪时间和观测的伪时间之间的线性回归关系。
133.i为针对pi-tb向pi-stb分化过程中，感染组与未感染病毒的stb-d3组 和stb-d4组的伪时间路径分析图；stb细胞根据分化事件和处理方法用不同 颜色标出：浅绿色表示stb-d3的正常细胞，蓝色表示感染的stb-d3，暗绿 色代表正常的stb-d4，红色代表感染的stb-d4，参考的路径用灰色表示。
134.j为气泡分析图，显示在空白对照组和estb感染组中，sars-cov-2病毒 基因、宿主因子如ace2、tmprss2、ctsl、ctsv、ctsb，天然免疫反应因 子、肿瘤坏死因子tnf信号通路，白介素通路以及tnf-α/nf-κb信号通路的 相关基因。气泡大小与表达水平成正比。
135.图5抗病毒药物瑞德西韦和gc376在estb的感染中，有效抑制sars
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cov-2及其变异株增殖的实验图，其中：
136.a为estb细胞模型进行sars-cov-2感染的实验流程图；epsc-tscs在 stb培养基中分化二天后形成estbs(stb-d2)，然后用0.1moi滴度的野生型 病毒(wt)及其变异株(delta和omicron)感染1小时，而后加入或不加抗 病毒药物(瑞德西韦和gc376)孵育。48小时后收集不同处理组的细胞上清液 或细胞裂解物用于转录组测序分析。
137.b为epsc-tscs分化形成的estbs后，抗病毒药物(瑞德西韦和gc376) 在不同浓度下分别对野生型sars-cov-2(wt)及其变异株(delta和 omicron)感染的抑制效应显现剂量依赖。
138.c为气泡图分析宿主因子、tnf-α/nf-κb信号通路、白介素通路、肿瘤坏 死因子tnf信号通路、天然免疫反应通路和sars-cov-2病毒基因。气泡大小 显示表达水平高低。
139.d为早期stb感染或不感染病毒后48小时，用瑞德西韦或gc376处理或 空白处理，盒状图分析上调和下调表达的基因。
140.e为有/无瑞德西韦(10μm)或gc376(10μm)处理组感染epsc-estb， 48小时后比对伪时间路径图；其中，不同处理组的细胞用不同的颜色标注：红 色指未进行任何药物处理的感染细胞，绿色是指空白对照组(不进行病毒感染， 也无任何药物处理)，浅蓝色指用瑞德西韦处理的病毒感染组细胞，深蓝色是 指用gc376处理的感染组细胞。
141.图6是建立epsc-tsc胎盘类器官模型及新冠病毒感染试验结果图，其中：
142.a为由epsc-tscs产生胎盘类器官模型光镜照片。显示了从单个的细胞到 第4天的类器官以及第20天的类器官形态。
143.b为胎盘类器官冰冻切片(上图)和石蜡包埋切片(下图)的h&e染色。 外圈层细胞是前体细胞。上图冰冻切片图中箭头所示为密集的致密细胞呈簇状 集中于类器官的外缘。下图石蜡切片图中箭头所示为类器官中多核的合胞体滋 养层细胞。
144.c为滋养层类器官冰冻切片的免疫荧光染色，检测tfap2a、yap1蛋白和 stb标志蛋白cd46、cgb的表达。
145.d为在epsc-tscs和胎盘类器官中，rt-qpcr检测滋养层细胞转录因子基 因(tead4、cdx2、itga6和gata3)、stb标志基因(ervw-1和cgb)及 evt标志基因(itga1、itga5)的表达。
146.e为对胎盘组织来源的滋养层细胞(ct-tsc、ct-stb、t-evt)及胎盘类 器官(ct-tsc-org为ct-tsc诱导分化的类器官；胎盘组织分化的类器官命 名为placenta-org)、epsc诱导的滋养层细胞(epsc-tsc,epsc-stb,epsc
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evt)和epsc-tsc诱导的胎盘类器官(epsc-org)进行的3d pca分析。
147.f为热图显示epsc-org中的tsc和stb基因表达情况，与从ct
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tsc(ct29,ct30和bts11)来源的胎盘类器官相似。
148.g为epsc-tsc/stb/evt和epsc-tsc产生的类器官(epsc-org)中 ace2和tmprss2的表达水平柱状图。右侧图显示的是病毒感染epsc-tsc 细胞、estb(stb-d2)和类器官后的上清液在不同时间点rt-qpcr检测 sars-cov-2病毒基因拷贝数。
149.h为在病毒感染的滋养层类器官中，石蜡切片的免疫荧光染色检测sars
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cov-2n蛋白、ace2、e-cadherin和cgb蛋白。感染的细胞是阳性表达ace2 和sars-cov-2n，但大部分不表达cgb。其中，白色箭头表示单个细胞核的 感染细胞表达sars-cov-2n，黄色箭头指向一个大的多核融合的合胞体滋养 层细胞、高表达cgb但显示sars-cov-2n染色阴性。
150.图7是从hepscs产生滋养层干细胞(htscs)及滋养层细胞亚型补充图； 其中：
151.a为采用rt-qpcr分析epsc-tsc(第10代)和bst-tsc(第3代)中， 滋养层细胞标志基因(elf5、tfap2c、tead4、tp63和gata3)的表达水平 图。
152.b为在hepsc、epsc-tsc和bst-tsc中，rt-qpcr检测滋养层细胞特异 性的c19mc小rna(mirnas)，包括(has-mir-517a，has-mir-517b，has-mir
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525-3p和has-mir-526-3p)表达水平的结果图。
153.c为rt-qpcr检测epsc-tsc和bst-tsc的hla-a和hla-b基因，呈低 表达水平。
154.d为在epsc-tsc和bst-tsc中，流式细胞定量分析hla-a、hla-b、 hla-c蛋白表达的结果图。
155.e为在epsc-tsc和bst-tsc中，rt-qpcr分析cdx2和可能的羊膜细胞 标志基因muc16和gabrp的表达水平，以及滋养层细胞标志基因elf5和 gata3的表达水平。
156.f为在epsc-tsc和bst-tsc，以及由hepsc向htsc诱导分化的第5天 (d5)中检测cdx2和可能的羊膜细胞标志基因的表达水平。
157.g为热图分析在不同来源的htsc中，滋养层细胞标志基因和可能的羊膜 细胞标志基因的表达模式。
158.h为从epsc-tsc向stb诱导分化，在第2、4、6天的代表性形态学图； 箭头指向多核的stb(虚线框所示)。
159.i显示epsc-tsc诱导的stb(d6)的不同的形态和标志分子cgb和 gcm1表达。有单
核、双核和多核的stb。多核的、成熟的stb表现为胞浆中 颗粒状的cgb阳性染色。dapi染色细胞核。标尺为100μm。
160.j为从epsc-tsc向stb诱导分化，在第2、3、6天上清中elisa检测人 绒毛膜促性腺激素(β-hcg)的水平；stb培养基作为空白对照。
161.k为从epsc-tsc向evt诱导分化第8天形成evt，免疫荧光共聚焦染 色检测itga1和itga5。
162.l为从epsc-tsc向evt诱导分化第8天形成evt，免疫荧光染色检测 gata3和hla-g；其中，箭头显示成熟的evt(梭形)高表达hla-g而低表 达gata3。
163.m为在epsc-tsc向evt诱导分化第8天形成的evt，采用流式细胞术 定量分析evt标志分子itga5和itga1的水平。
164.n在胎盘组织建立的htsc(ct/bts-htsc)、滋养层亚型细胞(ct/bts
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stb,ct/bts-evt)和epsc来源的滋养层细胞(epsc-tsc，epsc-tsc向 stb分化的第2，4，6天的stb和epsc-tsc向evt分化的第4，6，8天的 evt)，转录组pca分析结果图。
165.o分析比较胎盘组织建立的htsc(ct/bts-htsc)及滋养层亚型细胞 (ct/bts-stb,ct/bts-evt)与epsc-tsc及其分化的stb和evt中，人白 细胞抗原(hla)系列基因(hla-a,b,c,g)的表达水平。
166.图8是hepscs诱导的滋养层细胞与人围植入期胚胎和早中期胎盘细胞的 比较分析补充图，其中：
167.a是图2b中的人围植入期和胎盘组织中滋养层细胞标志基因tead4、 tp63、cgb5、csh2、hla-g和mmp2表达水平的小提琴图。
168.b是图2b中的人围植入期胚胎和胎盘组织的滋养层细胞中检测ame标志 基因(muc16、gabrp、vtcn1、itgb6、isl1和cdx2)表达水平的小提琴 图。
169.c是对体外epsc诱导的滋养层细胞和人围植入期胚胎和胎盘组织的滋养 层细胞，转录组pearson相关系数分析；其中，人围植入期胚胎和胎盘组织的 滋养层细胞包括囊胚和胎盘来源htsc(bst-tsc，ct-tsc)、stb类群(bst
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stb，ct-stb)和evt类群(bst-evt，ct-evt)；体外epsc滋养层细胞包 括epsc-tsc以及由其分化的stb和evt。
170.d上图和下图分别是囊胚来源的htsc(bst-tsc)及其stb和evt， epsc来源的htsc及其stb和evt中，羊膜细胞标记基因的表达水平分析。 gata3是一个非羊膜基因，用作内参。
171.e上图为ace2与cd46、cgb5、eng和csh2表达的线性相关分析，线 性回归用黑色虚线表示。下图是人围植入期和胎盘组织中cd46、cgb5、eng 和csh2的表达umap分析图。
172.f为人围植入期和胎盘组织滋养层细胞中tmprss2，bsg和axl的表达模 式图。
173.g为囊胚和胎盘来源的htsc(bst/ct-tsc)及其evt中ace2和 tmprss2的表达信号分析。最下部图显示ace2和tmprss2在基因组的位点 区域，每一条竖线代表一个外显子，转录从右侧向左侧进行。
174.h为hepsc和epsc来源的htsc及其evt中ace2和tmprss2的表达 信号分析。最下部图显示ace2和tmprss2在基因组的位点区域，每一条竖 线代表一个外显子，转录从右侧向左侧进行。
175.图9早期合胞体滋养层细胞estb高度易感sars-cov-2的试验结果补充 图，其中：
176.a为hepsc和epsc-tsc感染sars-cov-22小时和48小时后，rt-qpcr 定量检测细胞裂解物中病毒基因组拷贝数。
177.b为hepsc感染病毒48小时后，免疫荧光检测多能性标志分子oct4和 ssea3以及ace2和sars-cov-2的n蛋白；hepsc不表达ace2因而也不被 病毒感染。
178.c为bst-tsc感染病毒24小时后，免疫荧光共聚焦检测sars-cov-2n 蛋白；下图是sars-cov-2n蛋白染色显阳性的bst-tsc的比例。n＝36,表示 随机选择36个免疫荧光染色视野用于统计。
179.d为bst-tsc病毒孵育24小时后，免疫荧光检测sars-cov-2n蛋白、 ace2、krt7和te标志分子enpep。
180.e为使用pxgl培养体系在mef细胞上培养的人原始干细胞(h1)形态 图。
181.f为在人原始干细胞与人epsc中，rt-qpcr检测原始干性标志基因的表 达水平。
182.g为免疫荧光检测原始干细胞中标志多能性分子klf17和cd75的表达。
183.h为人原始干细胞诱导建立的htsc形态图。
184.i为在与epsc-tsc细胞中，rt-qpcr定量分析tsc标志基因 的表达水平
185.j为在与epsc-tsc细胞中，rt-qpcr定量分析羊膜标志基因 isl1和muc16的表达水平。
186.k为免疫荧光共聚焦检测tfap2,tp63和ck18在细胞的表达。
187.l为细胞孵育病毒24小时后，免疫荧光检测sars-cov-2n蛋 白。右侧图是sars-cov-2n蛋白染色显阳性的细胞百分比。n＝60， 是指60个随机挑选60个荧光视野图像进行统计。
188.m为细胞中，免疫荧光检测te标志分子enpep、ace2和 sars-cov-2n蛋白。
189.n为在stb-d2细胞中，免疫荧光检测cgb的表达。点线框指示多核的 cgb阳性细胞。
190.o为stb-d2细胞中cgb阳性细胞的定量百分比。n＝8是指统计8个荧光 视野，共计数了5820个细胞。右侧图是stb-d2细胞中单核，双核与多核细胞 的比例。n＝40,是指统计40个随机荧光视野，共计数了6734个细胞。
191.p为在epsc-tsc和epsc-tsc向stb分化的d2,d4和d6的细胞中，分 析stb基因cd46和cgb5的表达水平。
192.q为孵育病毒24小时后，免疫荧光检测sars-cov-2n蛋白。 右图是sars-cov-2n蛋白染色显阳性的细胞的比例。n＝58是指统 计检测了58个荧光视野。
193.r为孵育病毒24小时后，免疫荧光检测ace2、sars-cov-2n 蛋白、gata2和成熟的stb标志分子cgb表达图。点线框内显示单核与双核 的早期stb，白色箭头指示感染的cgb阳性细胞。
194.s为epsc-tsc向evt分化的第8天evt细胞，与病毒共孵育，分别在 感染后2、24、48和72小时，rt-qpcr检测上清液和细胞裂解物中sars
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cov-2病毒基因拷贝数。
195.t为evt经病毒孵育48小时后，免疫荧光检测sars-cov-2的n蛋白； 右图为感染的evt比例。n＝36是指统计36个荧光视野。
196.u为sars-cov-2感染evt，免疫荧光检测sars-cov-2的n蛋白和evt 标志分子hla-g。
197.v为在空白和感染组的evt中，48小时后分析ace2、tmprss2和 sars-cov-2基因表达水平。颜色是按照z值评分，气泡大小根据表达水平来 界定。
198.图10为sars-cov-2野生型和变异株delta和omicron在estb中增殖的 补充图，其中：
199.a是vero e6细胞，epsc-estb和人诱导多能干细胞来源的estb(hipsc
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estb)三株细胞的sars-cov-2感染，病毒复制的动力学分析。细胞分别用 sars-cov-2野生型、delta变异株和omicron变异株以0.001moi进行感染。 收集细胞上清液在2h、24h和48h，用rt-qpcr检测病毒载量。
200.b为和bst-estb细胞的sars-cov-2感染，病毒复制的动力 学分析。细胞分别用sars-cov-2野生型、delta变异株和omicron变异株以 0.1moi进行感染。收集细胞上清液在2h、24h和48h用rt-qpcr检测病毒载 量。
201.c左图为感染sars-cov-2野生型后，stb-d3和d4上调和下调的基因。 右侧是感染的stb和空白对照的stb基因表达相关性分析。
202.d为感染sars-cov-2野生型后，感染的stb和空白对照的stb差异表达 的前50个基因；红色表示上调基因，蓝色表示下调的基因。
203.e为基因集富集分析(gsea)显示stb-d3、stb-d4、vero e6在野生型 sars-cov-2病毒感染后，与对照组细胞比较，分析细胞周期和凋亡通路变化。
204.f为在野生型sars-cov-2病毒感染vero e6和estb 72小时后，用 tunel方法检测细胞凋亡。vero e6显现细胞脱落，并呈现出强烈的绿色荧光 信号提示细胞凋亡。estb未显示明显的细胞凋亡。白色箭头指向一些凋亡细 胞。
205.g为野生型sars-cov-2病毒感染后，感染组和空白对照组比较分析， herv-k和herv-frd的转录信号变化。
206.h为对野生型sars-cov-2病毒感染后，感染组和空白对照组go和 kegg比较分析。
207.i是vero e6细胞进行sars-cov-2病毒感染后，检测sars-cov-2、宿主 因子ace2、tmprss2、ctsv和ctsl、ctsb，以及天然免疫因子、tnf信号 通路白介素信号通路、tnf-α/nf-κb信号通路相关基因的表达。rna-seq数据 来源于(riva et al，2020)。
208.图11抗病毒药物瑞德西韦和gc376在estb的感染中，有效抑制sars
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cov-2及其变异株增殖的补充图，其中：
209.a为瑞德西韦和gc376分别处理48小时后，estb的细胞活力检测。
210.b为病毒载量检测显示瑞德西韦和gc376对野生型sars-cov-2病毒感染 estb的抑制效应。
211.c为estb感染sars-cov-2病毒，瑞德西韦或gc376处理组，48小时后， 免疫荧光染色检测gata3(绿色)、cgb(红色)和sars-cov-2n蛋白(粉 色)。
212.d为naive-tscs分化形成的estbs后，抗病毒药物(瑞德西韦和gc376) 在不同浓度下分别对野生型sars-cov-2(wt)及其变异株(delta和 omicron)感染的抑制效应显现剂量依赖。
213.e为在epsc-tsc及其向stb分化的第2、4、6天的细胞中，检测ace2、 tmprss2和dpp4
的表达。
214.f为epsc-estb以0.1moi感染mers-cov，瑞德西韦或gc376处理。48 小时后，搜集细胞上清液rt-qpcr定量检测病毒拷贝数。
215.g为estbs经sars-cov-2感染或不感染，瑞德西韦/gc376处理或不处理 比较，rt-qpcr检测mda5、ifnls、il6、il8、tnf和ifn-β基因表达水平的 变化。
216.h为estbs经sars-cov-2感染或不感染，瑞德西韦/gc376处理或不处理， 转录组分析基因表达相关性。不表达的基因已经被剔除，cpm用于表示pearson 相关系数。
217.图12是sars-cov-2感染epsc-tsc诱导的胎盘类器官实验结果补充图；
218.a为免疫荧光染色检测胎盘类器官中tfap2c、gata3、e-钙黏蛋白的表 达；
219.b为胎盘类器官石蜡包埋切片，免疫荧光染色检测cd46、gata3、 endou和cgb；
220.c为rt-qpcr检测epsc-stb、epsc-tsc和胎盘类器官中，stb相关基 因(ervw-1和cgb)表达水平。
221.d为elisa(units/ml)定量检测胎盘类器官培养上清中hcg-β的分泌水平； 其中，以胎盘类器官培养基作为空白对照。
222.e为epsc-tsc及其分化胎盘类器官中，rt-qpcr检测滋养层细胞特异性 c19mc微小rna(mirnas)如(has-mir-517a、has-mir-517b、has-mir-525-3p 和has-mir-526-3p)的表达水平；其中，以mirna103a作为内参。
223.f为胎盘类器官在evt分化培养基中分化8天后，evt样细胞从类器官迁 徙出的形态图；其中，免疫荧光染色显现hla-g、itga5和krt7阳性，细胞 核经dapi染色。
224.g为在胎盘类器官及其分化的evt中，rt-qpcr检测evt相关基因hla
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g、itga5、mmp2和itga1的表达水平。
225.h胎盘类器官经sars-cov-2-感染，石蜡包埋切片免疫荧光染色检测 gata3、cd46和sars-cov-2n蛋白d。其中，感染的细胞主要位于类器官的 周边，虚线框显示放大视野，箭头指示感染病毒的细胞，显现gata3(绿色) 或cd46(红色)和sars-cov-2-n(粉色)染色阳性。
具体实施方式
226.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 作进一步地详细描述。
227.实施例1实验方法、检测方法
228.1.1细胞株
229.人胚胎干细胞(hescs)man-1/m1转化为人扩展潜能干细胞(hepscs)， 在sto饲养层细胞上培养。经过放射处理的sto细胞以～3.125
×
104cells/cm2密 度在0.1％明胶铺过的培养板上提前3-4天准备好，常规用m10培养基培养 (配方为：knockout dmem+10％胎牛血清，1
×
谷氨酰胺青链霉素+1
×
(mem) 维生素溶液)。
230.人结肠上皮caco-2细胞和非洲绿猴的vero e6细胞购自atcc，在 dmem+10％热失活的胎牛血清+50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素的培养基中培 养。所有细胞以37℃在5％co2培养箱中进行培养，并用plasmotest (invivogen)常规检测支原体。
231.1.2病毒
matrix)的培养板里面。经4-5代的 传代，滋养层干细胞收集用于合胞体滋养层细胞和绒毛外滋养层细胞的分化。
241.1.7人扩展潜能干细胞来源的滋养层干细胞向合胞体滋养层细胞(stb) 定向分化
242.使用细胞外基质胶matrigel(使用浓度为100
×
)包被6孔细胞培养板，包 被时间为至少1小时。包被好的细胞培养板接种密度为10万每孔的滋养层干细 胞，每孔使用合胞体滋养层细胞培养基2毫升。胞体滋养层细胞培养基的组成 为：dmem/f-12培养基中加入50μmβ-硫基乙醇，0.5％青霉素-链霉素-谷氨酰 胺溶液，0.3％牛血清白蛋白，1％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液，2.5μm y
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27632，2μm毛喉素(sigma-aldrich，cat.f3917)和4％血清替代物(thermo.cat. 10828028)。
243.1.8人扩展潜能干细胞来源的滋养层干细胞(epsc-tsc)向绒毛外滋养 层细胞(evt)定向分化
244.向绒毛外滋养层细胞定向分化，先用细胞外基质胶matrigel(使用浓度为 100
×
)包被6孔细胞培养板，包被时间为至少1小时。包被好的细胞培养板接 种密度为10万每孔的滋养层干细胞，绒毛外滋养层细胞基础培养基3毫升。绒 毛外滋养层细胞基础培养基的组成为：dmem与f-12培养基中加入50μmβ-硫 基乙醇，0.5％青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液，0.3％牛血清白蛋白，1％胰岛素
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转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液，2.5μm y-27632和7.5μma83-01。前两天分化，在绒 毛外滋养层细胞基础培养基中加入4％血清替代物，100ng/ml nrg1和2％细胞 外基质matrigel(basement membrane matrix)。第三天，换成2毫升 绒毛外滋养层细胞基础培养基中加入4％血清替代物和0.5％细胞外基质 matrigel的培养基。第6天，换成2毫升绒毛外滋养层细胞基础培养基中加入 0.5％细胞外基质matrigel的培养基，接着培养2天。第8天，收集细胞进一步 分析。
245.1.9人扩展潜能干细胞来源的滋养层干细胞(epsc-tsc)产生胎盘类器 官
246.人扩展潜能干细胞经消化分离试剂tryple处理，移液器吹打成单细胞。 细胞经离心收集备用。先准备胎盘类器官液滴，40μl体积的液滴含有60％细胞 外基质matrigel(matrigel为细胞因子减低型的matrigel)和40％的胎盘类器官 培养基。取10万收集的细胞，混匀到一个液滴中，小心接种到24孔细胞培养 板的中间。放入37℃二氧化碳细胞培养箱中3分钟预凝固。3分钟后，拿出来 上下摇晃，确保细胞在液滴中均匀分布。再放入细胞培养箱中15分钟，使液 滴完全凝固，呈现拱球形态。小心加入500微升胎盘类器官培养基于每个孔。 胎盘类器官一般经4-6天形成第一代。经胎盘类器官培养基培养20天成熟的胎 盘类器官用于sars冠状病毒的感染实验。胎盘类器官培养基的组成为： n2b27基础培养基中加入50ng/ml重组人表皮生长因子，1.5μm的chir99021， 80ng/ml重组人r-spondin-1蛋白，100ng/ml重组人成纤维细胞生长因子， 50ng/ml重组人肝细胞生长因子，500nm的a83-01，2.5μm的前列腺素e2， 2μm的y-27632。胎盘类器官培养基可以存放在4度冰箱保存2周。
247.1.10 sars-cov-2感染细胞实验
248.sars-cov-2株(sars-cov-2hku-001a；genbank登录号mt230940) 从香港一名covid-19患者的鼻咽抽吸标本中分离得到。使用vero e6细胞增 殖sars-cov-2株，并通过空斑试验测定上清滴度。所有涉及活体sars-cov
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2的实验，均遵循香港大学玛丽医院生物安全三级设施批准的标准操作程序。
249.在病毒感染前一天接种hepscs，并在合适的时间点接种其他类型的分化 细胞。在
感染当天，用pbs冲洗细胞，并在基础培养基中稀释病毒，以指示的 感染复数(moi)感染细胞。细胞在37℃下孵育2小时。随后，用完全培养基 更换细胞上清液，并进一步培养直至收集。每天通过光学显微镜监测细胞病变 效应(cpe)，并收集指定时间点的细胞上清液和细胞裂解液进行rt-qpcr以 评估病毒rna载量，该载量已通过斑块分析校准为病毒载量测定。
250.1.11 sars-cov-2rt-qpcr评估病毒rna载量
251.在不同时间点采集sars-cov-2培养的细胞上清液进行病毒检测。取 140μl的培养上清液，用560μl的avl缓冲液裂解，随后用viralrna mini kit(qiagen.cat.52906)提取总rna。
252.提取的rna用quantinova probe rt-pcr试剂盒(qiagen.cat.208354) 进行定量分析病毒复制动力学。每个20μl反应混合物包含10μl 2
×
quantinova 探针rt-pcr主混合物、0.2μl quantinova探针rt混合物、各1.6μl 10μm正 反引物、0.4μl 10μm探针、5μl提取的rna模板和1.2μl无核糖核酸酶水。 反应体系在45℃下孵育10min进行反转录，95℃下孵育5min进行变性，95℃ 下孵育5s进行45个循环，55℃下孵育30s，然后在40℃下冷却30s。引物和 探针序列sars-cov-2的rna依赖性rna聚合酶/解旋酶(rdrp/hel)基因 相关的区域见表1。
253.表1 pcr引物序列表
254.过夜。取下琼脂糖塞后，用0.7％结晶紫(bdh，merck)染色，计数斑块，空 斑试验共进行3个重复。
258.1.13利用早期合胞体滋养层细胞(estb)进行抗sars-cov-2和mers
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cov药物评价
259.epsc-tsc长到80％的密度，经dpbs清洗一遍细胞后，用细胞消化酶 tryple
tm express酶(1x)消化5分钟，用m10培养基中和消化(m10:酶＝1:1)， 吹散成单细胞，300g离心3分钟，去上清重悬于stb分化培养基。接种到 geltrex包被的96孔细胞培养板，培养2天后即为estb。
260.在感染当天，用pbs冲洗细胞，并在stb培养基中稀释病毒(例如 sars-cov-2、其变异株delta\omicron或者mers-cov)，以指示的感染复数 (例如moi＝0.1)感染细胞。细胞在37℃下孵育1小时。经dpbs清洗一遍 细胞后。用含有不同浓度药物的stb培养基更换细胞上清液，并进一步培养直 至收集。每天通过光学显微镜监测细胞病变效应(cpe)，并收集指定时间点 (例如48小时后)的细胞上清液和细胞裂解液进行rt-qpcr检测，以评估病 毒rna载量，确定药物抗病毒的效果。
261.1.14逆转录-定量聚合酶链反应(rt-qpcr)
262.使用qiagen公司的rneasy mini kit试剂盒进行总rna提取，按照制造商 的说明。分离的rna用fastking gdna diselling rt supermix试剂盒(tiangen) 通过pcr仪逆转录为互补(cdna)。powerup
tm
sybr
tm
green master mix试剂 盒(applied biosystems)用于检测细胞内sars-cov-2和基因表达。引物序列 见表1。所有qpcr实验均使用steponeplus
tm
real-time pcr系统(appliedbiosystems)进行。采用δct法将病毒rna载量和基因表达水平归一化至 gapdh。数据分析采用prism 8(graphpad)单/双侧student's t-检验。
263.1.15免疫荧光染色
264.样品固定在4％多聚甲醛(sigma.cat.p6148)室温下浸15分钟，用0.3％ triton-x100(sigma.cat.t8787)处理30分钟，用10％驴血清(sigma.cat. d9663)和1％bsa(sigma.cat.a2153)阻断3小时，然后与一抗在4℃的环境 中孵育一夜。荧光偶联二抗在室温下孵育1小时。抗体染色后，用10μg/mldapi(thermo fisher scientific.cat.62248)反染色10分钟，标记细胞核，荧 光显微镜观察。
265.1.16蛋白质免疫印记
266.蛋白质在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上分离(bio-rad.cat.1610180)，并根据 制造商的指导转移到bio-rad transblot的pvdf膜上。使用以下一抗兔ace2 (1:500，abclonal.cat.a4612)，兔β-肌动蛋白(1:5000,abmart.cat.p30002m)。 山羊抗兔igg h&l(hrp.cat.ab205718)作为二抗。利用chemidoc成像系统 对图像进行成像和分析。
267.1.17流式细胞检测
268.用0.25％胰蛋白酶/edta在37℃条件下消化hepscs 2-3分钟，移液分离 至单细胞。分离的细胞用40μm尼龙网(康宁公司，cat.352235)去除结块。 离心后，根据生产厂家的说明书(bd cytofix,cat.554655)使用固定培养基固 定细胞。洗涤后的细胞置于含0.1％nan3(sigma.cat.199931)和5％fbs (gibco.cat.10270)的pbs中，4℃保存，然后用流式细胞术分析。所有样品 均采用acea novocyte quanteon进行分析，488nm(530/30带通滤波器)和 561nm(610/20带通滤波器)通道检测fitc，排除自身荧光。采用405nm (445/45带通
滤波器)通道检测dapi阳性细胞。流式细胞仪数据采用flowjo 软件进行分析。
269.1.18 transwell侵袭实验
270.tsc分化evts的侵袭能力通过细胞侵袭能力(354480,corning，city， usa)根据厂家说明进行测定。将侵入室与温暖的dmem基底培养基在37℃ 下孵育1小时，复水后将培养基移走。etsc-evts(1
×
105细胞/孔)在dmem 基础培养基中制备。将混合物加入侵入室，置于24孔培养板中，下室充满含 10％胎牛血清的dmem。让细胞通过腔室，附着在聚碳酸酯膜的下底部22小 时后，抽吸顶部插入物的培养基，用棉芽擦拭上表面的非侵袭/迁移细胞。下表 面浸润/迁移的细胞用结晶紫染色15min，光镜下观察细胞膜。
271.1.19转录组测序及分析
272.cutadapt用于去除接头数据和低质量的3’端数据。读数与hisat2组装的人hg38基因组相映射。用ensembl进行基因注释。featurecounts用于定量基因表 达量。平均数少于5的基因被滤除。转座子注释是从ucsc基因组浏览器 (repeatmasker)中获得。squire中全部的模式用于定量te的表达。deseq2 用于分析差异表达的基因和转座子。基因和转座子中表达量大于1.5倍变化的 以及p值小于0.05的被认为是有显著性差异的。r程序包集群分析器用于go 分析和kegg分析。gsea软件用gseapy程序包运行，基因组合是直接从 https://www.gsea-msigdb.org.下载而来的。比格伟格文件的转录组测序信号是由 deeptools的bamcoverage生成的，igv用于可视化。对于内源性逆转录病毒 herv-w、herv-frd和herv-k的转录组测序信号，genbank中的编号分别 是ay101582.1，bc068585.1和n675077.1，sars-cov-2的编号是mn985325， 读数都是用hisat2进行映射和定量分析。e-mtab-10429中储存的数据，处理 后的读数表可直接使用。
273.1.20单细胞转录组测序数据处理
274.运用scanpy管线进行单细胞转录组测序(wolf,f.a.，angerer,p.& theis,f.j.scanpy:large-scale single-cell gene expression data analysis.genomebiology 19，15，doi:10.1186/s13059-017-1382-0(2018).)。围植入前、植入后 每百万细胞的转录本从zhou数据库提取(gse109555)(zhou，f.et al. constituting the transcriptome and dna methylome landscapes of humanimplantation.ture 572，660-664，doi:10.1038/s41586-019-1500-0(2019).)，胎盘 细胞是从liu的数据库(gse89497)中提取的(liu，y.al.single-cell rna-seqreveals the diversity of trophoblast subtypes and patterns of differentiation in thehuman placenta cell research 28，819-832，doi:10.1038/s41422-018-0066-y (2018).)。最初研究中细胞是用他们的分期和谱系分成7个主要集群(3个是 植入前、植入后囊胚，3个在早期胎盘，1个是在中期胎盘，zhou的数据库注 释是从castel等的报道中来(castel，g.et al.induction of human trophoblaststem cells from somatic cells and pluripotent stem cells.cell rep 33，108419， doi:10.1016/j.celrep.2020.108419(2020).))。这里我们就这两个数据库的伪时间 进行了分析。首先我们预处理了联合的数据库，运用1)tpm读数进行对数转 化；2)在每个基因范围扩增到10；3)减少了一些测序的深度。而后，我们通 过dpt用缺省参数方法计算了分散的伪时间(haghverdi，l.，b
ü
ttner，m.，wolf，f。a.，buettner，f.&theis，f.j.diffusion pseudotime robustlyreconstructs lineage branching。nature methods 13，845-848， doi:10.1038/nmeth.3971(2016).)。
去除那些不一致的分期和谱系注释的伪时间 参数，4041和952个细胞分别被获得而用于下游分析。基于对数值读数，对于 ace2等选择性的标志物运用皮尔森相关回归进行分析，运用散点图进行图示。 在比较在体细胞和离体参考之前尽量减少转录组测序的不同批次的影响。
275.1.21在体和离体胚外数据库的整合分析
276.实验中映射了离体原始的转录组测序数据与在体的转录组测序参考数据， 使用cvd模型进行整合分析。假定不管测序的类型是什么，最高的组分都可 以捕获细胞的特质和生物学变化。首先两个单细胞转录组数据库的批次差异被 减到最小，以构建一个包含从围植入期到胎盘组织阶段的胚外发育的概况。而 后使用在体的单细胞转录组的全转录组数据建立svd模型，产生了一个50组 分的分解结果。接着在同一空间运用已建立的模型投射离体细胞数据(单纯的 转录组测序数据)与这50个组分样本进行比较。通过链接50个样本的单纯的 转录组测序数据与单细胞转录组测序数据，再进行umap可视化分析。为了验 证svd模型在分辨细胞类型方面的有效性，在体部分细胞间类型变化也被捕 获在umap的每个类群簇中。
277.1.22在体单细胞转录组测序数据与离体细胞株转录组测序数据的全转录组 相关分析
278.转录组测序可能反映出单细胞转录组水平额外的作用，为此我们从在体单 细胞转录组测序制作了拟批次集。对于每个在体的亚型，我们随机地选择两组 中每组50个细胞作为伪批次集细胞，然后计算平均数以模拟每个类型的两个 批次的样本，因此就有了14个拟批次集样本。通过融合14个拟批次集样本与 离体细胞的数据(19个样本，10个类型)，计算了每两个样本之间的全转录组 数据的配对皮尔森相关系数，并以簇形图的形式展示出来以估算每个离体细胞 系的在体的相应的分期。
279.1.23整合的伪时间分析
280.首先，使用scanpy(scanpy.tl.dpt，缺省参数)为全部的在体参考数据估 算分散的伪时间。我们而后抽取了pi_tb和pi_stb集，作为后续在体st分化 细胞的伪时间分析参照集。有2295个pi_tb细胞和1282个pi_stb细胞，组 成了方向一致的分化轨迹。与前述的单纯的转录组测序数据与单细胞转录组测 序数据整合过程相似，运用单细胞转录组测序数据以减少两个数据集到一个共 同的50组分的空间维度，我们建立了一个50组分的svd模型。我们假设这 50个组分可以通过scanpy计算预测伪时间。使用 sklearn.linear_model.linearregression线性回归模型来进行机器学习。简单而言， 这50个组分以及1721pi_tb细胞和961个pi_stb细胞(也就是每个类群中 的75％的细胞)的伪时间用于训练线性回归模型，剩下的25％测试集中的细胞 用于验证模型。验证结果使用密度图进行图示。在证实了模型的有效性之后， 我们应用该模型去预测离体分化细胞的伪时间。我们也通过以下的线性方程在 预测值和观测值之间计算了离体细胞理论上的观测伪时间。每个数据集中的伪 时间而后被融合，展示为每个细胞的相应的分化阶段。
281.观测的伪时间＝1.022
×
预测的伪时间-0.0032
282.而后每个数据集的伪时间被整合起来分析每个细胞相关的分化阶段。
283.实施例2扩展潜能干细胞诱导的滋养层干细胞(epsc-tscs)及亚型合胞体 滋养层细胞(stb)和绒毛外滋养层细胞(evt)
284.基于已发表的培养条件(okae，h.et al.derivation of human trophoblaststem cells.cell stem cell 22，50-63.e56，doi:10.1016/j.stem.2017.11.004(2018).) 我们从m1-hepscs建立了几株新的滋养层干细胞(htsc)细胞株。m1
‑ꢀ
hepscs是从人primed状态的胚胎干细胞株m1(gao，x.et al.establishment ofporcine and human expanded potential stem cells.nature cell biology 21，687-699， doi:10.1038/s41556-019-0333-2(2019).)转化而来，培养时加入了三种小分子 抑制剂chir99021,a419259和xav939，以分别抑制gsk3β，src激酶家族和 tankyrases三种通路(图1a和1b)。新建立的epsc-tscs用于后续进一步验 证。近来发现(gao，x.et al.establishment of porcine and human expandedpotential stem cells.nature cell biology 21，687-699，doi:10.1038/s41556-019
‑ꢀ
0333-2(2019).；guo，g.，stirparo，g.g.，strawbridge，s.e.，spindlow，d.， yang，j.，clarke，j.，dattani，a.，yanagida，a.，li，m.a.，myers，s.，etal。(2021)。human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential。cellstem cell,28，1040-1056e1046.)hepscs在向滋养层细胞分化时可以同时产生 滋养层细胞和羊膜样细胞(ame)。
285.epsc-tscs表达典型的htsc标志分子，如tfap2c、tp63、ck18、 gata3、elf5、tead4和krt7(图1b,1c,图7a)，以及滋养层特异性 c19mc微小rnas(has-mir-517c-3p，517-5p，525-3p和526b-3p)(lee， c.q.，gardner，l.，turco，m.，zhao，n.，murray，m.j.，coleman，n.， rossant，j.，hemberger，m.，and moffett，a。(2016a).what is trophoblast？acombination of criteria define human first-trimester trophoblast.stem cell reports 6， 257-272.)(图7b)，与人囊胚来源的tsc(bst-tsc)(okae，h.，toh，h.， sato，t.，hiura，h.，takahashi，s.，shirane，k.，kabayama，y.，suyama， m.，sasaki，h.，and arima，t.(2018).derivation of human trophoblast stemcells.cell stem cell，22，50-63.e56.)高度相似。epsc-tsc和bst-tsc均低表 达或者不表达hla i类分子hla-a和hla-b(图7c、图7d)。
286.转录组测序分析和单个基因的rt-pcr分析中，epsc-tscs并不表达现在 所知的ame标志基因如cdx2、muc16、gabrp、itgb6或vtcn1(图1d、 图7e,f)，与(chhabra and warmflash,2021；tyser et al,2021；xiang etal,2020；zhao et al,2021a；zheng et al,2019)从囊胚或胎盘组织建立的滋养层干细 胞(bst-tsc,ct-tsc,ct27-tsc,ct29-tsc,ct30-tsc,bts5-tsc和bts
‑ꢀ
11-tsc)极为相似。进一步在转录组水平对比不同来源的htsc细胞株，包括 epsc来源的(epsc-tsc)，primed胚胎干细胞和胚胎干细胞来源的， 以及体内组织来源的htsc(bst-tsc,ct-tsc)(dong et al,2020a；gao etal,2019；guo et al,2021；okae et al,2018；sheridan et al,2021)，epsc来源的htsc 与干细胞来源的htsc细胞株更为相似，与primed干细胞来源的htsc 不同(图1e、图7g)。
287.epsc-tscs诱导分化产生合胞体滋养层细胞(stbs)(图1f、图2f)。滋 养层前体细胞转录因子基因tp63表达降低而stb基因如gcm1、β-绒毛膜促 性腺激素3(cgb3)和cgb5则快速升高(图1g)。免疫荧光染色检测分化第 六天的合胞体滋养层细胞(stb-d6)显示gcm1阳性、cgb阳性并呈现多核 的stbs(图1h、图7i)，有些成熟的stbs显示gata3染色阴性(图1h)。 功能上，elisa检测stb-d6细胞上清，可检测出分泌的β-hcg激素(图7j)。
288.抑制tgfβ信号通路，epsc-tscs被高效地诱导分化为绒毛外滋养层细胞(evts)，呈
现典型的梭形evt细胞形态，免疫荧光染色显现krt7、hla-g、 itga1和igta5阳性(图1i、1j,图7k)。evt特征基因itga1、mmp2和 hla-g表达水平迅速升高而gata3表达水平降低(图1k)。某些成熟的evt 呈现hla-g阳性而gata3阴性(图7l)。epsc-tsc向evt诱导分化第八天， 80％细胞hla-g阳性，82％itga1阳性和95％itga5阳性。这些细胞不表达 经典的hlai类分子hla-a和hla-b(图1l、图7m)。功能上，epsc
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tsc分化的evts具有很强的侵袭能力(图1m)。
289.对于epsc-tscs及分化的stbs(d2,d4,d6-stbs)、evts(d4,d6,d8
‑ꢀ
stbs)人胎盘组织建立的tscs(ct-tsc,bts-tsc)及其分化的stb和evt， 转录组pca分析表明(sheridan et al,2021)，epsc-tscs与ct-tsc/bts-tsc 类似；epsc来源的stbs类似于ct-stbs/bts-stbs；epsc来源的evts类似 于ct-evts/bts-evts(图7n)。转录组测序证实这些tscs和亚型stbs、 evts都低表达hla i类分子hla-a和hla-b(图7o)。
290.实施例3hepscs诱导的滋养层细胞分子特征类似人围植入期的胚胎和胎 盘
291.为了验证hepsc体外诱导分化的滋养层细胞特征，将epsc-tscs分化的 滋养层细胞与人的围植入期胚胎和胎盘组织中的滋养层细胞进行对比。我们首 先提取体外培养的围植入期4041胚胎细胞(胚胎第6天到第14天)(zhou，f.， wang，r.，yuan，p.，ren，y.，mao，y.，li，r.，lian，y.，li，j.，wen， l.，yan，l.，et al.(2019).reconstituting the transcriptome and dna methylomelandscapes of human implantation.nature 572，660-664.)以及952个早期/中期 妊娠胎盘细胞(liu，y.et al.single-cell rna-seq reveals the diversity oftrophoblast subtypes and patterns of differentiation in the human placenta.cellresearch 28，819-832，doi:10.1038/s41422-018-0066-y(2018).)，根据发育时间 点(胚胎发育的天数或者妊娠的周数)(图2a)、发育的阶段和注释的亚型 (图2b)分别整合，进行umap分析。围植入期的细胞包含滋养层祖细胞 (pi-tb)，它们具有干性、可向围植入期evt(pi-evt)和围植入期stb (pi-stb)分化(图2b)。相应的，胎盘细胞也包含早孕期滋养层细胞(t1
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ctb)、t1-evt和t1-stb和中孕期evt(t2-evt)(图2b)。上述注释经特 异标志基因进行进一步验证，确认其属性(图8a)。值得注意的是，这些体内 来源的滋养层细胞并不高表达可能的羊膜细胞标志基因muc16、gabrp、 cdx2，但有些确实表达vtcn1、itgb6和isl1(图8b)。
292.我们随即将体外产生的epsc-tscs与其分化的stb、evt，囊胚或胎盘 组织经体外建立的tsc(bst-tsc,ct-tsc)及其分化的stb、evt(okae， h.，toh，h.，sato，t.，hiura，h.，takahashi，s.，shirane，k.，kabayama， y.，suyama，m.，sasaki，h.，and arima，t.(2018).derivation of humantrophoblast stem cells。cell stem cell 22，50-63.e56.)与体内的的滋养层细胞比 对和聚类分析(图2a、图2b)。体外的htscs(epsc-tsc，bst-tsc，ct
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tsc)类似于着床后的pi-tb(castel et al,2020)；stb细胞与pi-stb类似； evt类似于t1-evt(图2c)。pearson相关分析进一步确认上述比对和聚类分 析(图8c)。值得注意的是，epsc-tsc及其分化的stb和evt，与囊胚建立 的htsc(bst-tsc)及其stb和evt类似，都不表达可能的羊膜细胞标志基 因(图8d)。
293.为了检测滋养层细胞对于sars-cov-2的易感性，我们首先考察了sars
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cov-2宿主因子在体内滋养层细胞中的表达。sars-cov-2细胞表面受体基因 ace2高表达于pi-stb类群中的多个细胞(图2d-2e)。ace2与滋养层细胞标 志基因相关性分析发现，ace2的表达与stb标志基因的表达如cd46、cgb5、 eng和csh2(r＝0.245，0.200，0.207，0.248，p《
0.0001)(图8e)高度相关， 而与evt标志基因的表达则不相关(参下表)。
[0294][0295]
体内滋养层细胞数据中，pi-stb类群共同高表达ace2和tmprss2(图 3e、图4e)，pi-stb,t1-stb和t2-stb也可见一些共表达(图2e，图8f)， 分析结果与前人报道一致(ashary et al,2020；chen et al,2020)。sars-cov-2受 体相关基因比如bsg(wang et al,2020a)和axl(wang et al,2021)，并未发现 在哪个特定的类群中特异性的高表达(图4e)。
[0296]
体外培养的滋养层细胞(epsc-tscs、bst-tsc，ct-tsc，及其分化的 stbs和evts)皆表达ace2和tmprss2，且stbs表达水平最高(图2f、图 8g,s2h),而人epsc并不表达ace2或tmprss2(图8h)。体内和体外的滋 养层细胞的宿主因子表达模式提示stb对于sars-cov-2病毒潜在易感。
[0297]
实施例4 htsc可被sars-cov-2病毒感染
[0298]
为了检测滋养层细胞对sars-cov-2的易感性，我们对hepscs、epsc
‑ꢀ
tscs及其分化的stbs和evts进行sars-cov-2病毒感染，并进行了病毒复 制动力学的对比(图5a)。
[0299]
感染流程大概如下，各组细胞与sars-cov-2(hku-001a毒株； genebank no.:mt230940)共孵育2小时，pbs洗脱，再用新鲜的细胞培养基 培养24、48或72小时；收集上清和细胞裂解物用于病毒基因组检测和病毒抗 原分析。结果显示：hepscs不表达ace2(图8h)因而也几乎不被病毒感染， 细胞裂解物检测和上清液检测都未能检测到病毒，免疫荧光染色未见病毒n蛋 白阳性细胞(图3b、图9a,b)。与ace2和tmprss2低表达水平相对应(图 8h)，sars-cov-2可感染epsc-tscs，但免疫荧光显示仅有3-4％的细胞 sars-cov-2的n蛋白阳性(图3b-3c)。被感染的epsc-tscs显现ace2和 krt7染色阳性(krt7为滋养层细胞广谱标志分子)(图3d)。被感染的 epsc-tscs同时表达囊胚滋养外胚层(te)标志分子enpep(io et al,2021) (图3e)。enpep为sars-cov-2潜在受体(qi et al,2020)。与epsc-tscs感 染结果类似，约0.5～1％的源于人囊胚细胞的bst-tscs(okae et al,2018)可 被sars-cov-2感染，
感染细胞krt7,ace2和enpep均为阳性(图9c，图 9d)。bst-tsc在我们培养过程中似乎含有一些分化了的滋养层细胞，这或许 是产生少量ace2阳性细胞的原因。
[0300]
为了检测干细胞来源的htscs是否感染病毒，我们将人primed干细 胞(h1)经pxgl培养条件转化为干细胞(guo et al,2021)(图9e)。
[0301]
这些细胞表达原始的多能性基因dppa3,tfcp2l1,tbx3,klf17,klf2， dnmt3l和表面标志分子cd75(图9f和g)。呈现典型的鹅卵石 形状的tsc克隆，形态上与epsc-tscs和其他htscs相似(图9h)，表达高 水平的滋养层细胞标志基因gata2,gata3,tfap2c,tp63,tead4,ck18基因 而低表达或不表达ame相关基因isl1或muc16(图9i,j,k)。2～3％的 tscs可被sars-cov-2感染(图9l)且表达ace2(图9m)。感染的细胞也 共表达滋养外胚层标志分子enpep(图9m)
[0302]
在htscs培养中出现少量ace2阳性的细胞及通过sars-cov-2感染细胞， 提示了目前htsc培养的异质性，有待进一步研究。所观察到的htsc转录水 平类似于pi-tb(castel et al,2020)(图2c)，ace2阳性的htscs对sars
‑ꢀ
cov-2易感，提示了人围植入期胚胎尚存在潜在感染sars-cov-2的风险。
[0303]
实施例5 estb对sars-cov-2高度易感
[0304]
htscs分化的stbs皆共表达ace2和tmprss2(图2d，2e，2f和图 8f)。在htscs向stb分化中ace2和tmprss2的表达从第二天显著升高 (stb-d2)(图3f，3g)，因此stb也较htsc更加易感于sars-cov-2(图3h、图3i)。我们注意到被病毒感染的细胞通常表达早期stb标志分子 (ssea4、cd46)(gamage et al,2016；holmes et al,1992)(图3j)；多核的cgb 阳性的成熟stb不表达高水平的ace2，少量细胞被病毒感染(图3k)。这些 结果提示相对于成熟的stb，sars-cov-2更容易感染未成熟的或早期stb而 不是多核的、成熟的stb。
[0305]
分化第二天的stb(stb-d2)，多数细胞是单核的cgb阴性细胞，仅3％ 是多核的stb细胞(图9n,和图9o)。早期stb基因cd46在stb-d2短暂升 高，成熟stb标志基因cgb表达随分化逐渐升高(图9p)。ace2和 tmprss2表达在stb-d2开始快速升高(图9m，图3f、图3g)。我们之后就 用stb-d2进行后续病毒感染实验，并将其命名为早期stb(estbs)。
[0306]
sars-cov-2感染estbs(moi 0.1)，在孵育后2，24，48，72小时后搜 集上清液进行病毒rna载量的定量检测，结果提示，estbs培养上清中病毒 rna拷贝数在感染48及72小时后显著增加(图3l)，免疫荧光可见stb较 epsc-tsc阳性感染细胞也显著增加(图3m)。感染细胞裂解物中检测的病毒 基因组拷贝数显著地升高(》3 log
10
)(图3n)。plague实验证实了相当量的病 毒颗粒从感染的estbs细胞中被释放出来(图3o)。转录组测序结果有力地证 实sars-cov-2的产生，大量的病毒衣壳蛋白(e)、膜糖蛋白(m)、核衣壳蛋白 (n)和刺突蛋白(s)基因(图3p)被检测到，ace2和tmprss2表达水平却降低， 与前人报道一致(bane et al,2020)。免疫荧光染色sars-cov-2n蛋白也提示 病毒主要感染cd46阳性细胞，而非多核的stb细胞(图3q,3r,3s)。
[0307]
为了排除estb对于病毒易感并非epsc细胞特异性现象，我们也使用了 原始干细胞分化的estb并进行病毒感染(图9q)。免疫荧光染色显示了阳性 感染的细胞多数是单核的、cgb阴性细胞(图9r)。
[0308]
除了stb，epsc-tsc也可以分化为evts。epsc-evts表达低水平的 ace2和tmprss2
tb到 pi-stb的伪时间路径进行比对，发现感染组细胞较空白对照组更接近于pi-tb (图4i)。这些结果再次证明sars-cov-2对于早期stbs的感染广泛影响滋养 层细胞的发育和功能，这可能增加患covid-19的孕妇在早期妊娠失败的风险 (zhou et al,2021)。
[0318]
sars-cov-2感染导致强烈的天然免疫反应。在感染细胞中编码干扰素信 号组分的基因(ifnl1、ifih1)以及通过nf-κb通路的基因如tnfaip3和 nfkbia调控的tnf-α信号通路相关基因皆显著上调(图4e、图10d)。go 分析发现在病毒感染的estb中出现了诸多病毒导致的胞内反应和免疫反应通 路元件(图10h)。与预期的一致，kegg信号通路分析也揭示了冠状病毒疾 病covid19信号通路基因变化是最显著的通路(图10h)。气泡图进一步证实 了与天然免疫反应相关的系列基因上调，如白介素(il)和肿瘤坏死因子 (tnf)信号通路(图4j)。
[0319]
从冠状病毒基因组复制和转录出来的双链rna，一般是可以被细胞质中的 rna病毒识别基因(mda5/ifih1)所识别并引发冠状病毒所致的天然免疫活 化反应(kindler et al,2016；li et al,2021)。ifih1在感染细胞显著上调(图4j)。 同时，人们并不清楚dna是否也参与sars-cov-2的生命周期。我们检测了 的编码cgas和sting的基因表达水平，这些监测细胞胞浆dna的cgas和sting天然免疫通路组分并未见显著变化(图4j)。
[0320]
针对病毒感染，干扰素启动一系列级联反应以刺激多种基因表达产生细胞 内抗病毒反应。type iii型干扰素有着抗病毒的重要功能(ye，l.，schnepf， d.，and staeheli，p。(2019)。interferon-λorchestrates innate and adaptivemucosal immune responses。nature reviews immunology 19，614-625.)，尤其是 ifn-λ1被报道是持续在人胎盘滋养层细胞中持续表达以保护胎儿免受病毒感染 (bayer，a.，lennemann，n.j.，ouyang，y.，bramley，j.c.，morosky，s.， marques，e.t.，jr.，cherry，s.，sadovsky，y.，and coyne，c.b.(2016).typeiii interferons produced by human placental trophoblasts confer protection againstzika virus infection.cell host microbe 19，705-712.)。type iii型干扰素ifns也 被报道在气道和小肠上皮具有限制sars-cov-2感染的作用(stanifer，m.l.， kee，c.，cortese，m.，zumaran，c.m.，triana，s.，mukenhirn，m.， kraeusslich，h.g.，alexandrov，t.，bartenschlager，r.，and boulant， s.(2020).critical role of type iii interferon in controlling sars-cov-2infection inhuman intestinal epithelial cells.cell rep 32，107863.)。我们实验发现感染细胞 表达高水平的iii型干扰素包括ifn-λ1(il-29、ifnl1)、ifn-λ2(il-28a、 ifnl2)、ifn-λ3(il-28b、ifnl3)和ifn-λ4(ifnl4)(图4j)。oas1是近 来报道的ifn信号通路下游基因，可以刺激rna酶l并特异性的抑制病毒。 我们发现感染的早期stb高表达oas1基因(图4j)。
[0321]
与报道中的vero e6细胞干扰素信号通路和tmprss2表达缺失相一致 (osada et al,2014；sasaki et al,2021)我们也发现vero e6表达ace2而不表达 tmprss2(图10i)(riva et al,2020)。在感染的vero e6细胞中，干扰素基因 ifnb1,irf3,tbk1没有变化，抗病毒效应因子oas1仅仅有轻度上调(图10i)。
[0322]
在tmprss2缺失的vero e6细胞细胞中omicron变异株显著增殖，如图 4b，图10a,b，可能是由于omicron比其他变异株更依赖于组织蛋白酶 cathepsins或者其他胞内蛋白酶(beumer et al,2021；hui et al,2022；koch etal,2021；shuai et al,2022)。vero e6细胞表达cathepsins l(ctsl)和cathepsinsl2(ctsv)，感染后它们表达下调(图10i)。相
似的是，estb表达这两个组 织蛋白酶基因，而在感染后表达下降(图4j)，可能是由于omicron在estb中 复制的某种机制但仍需深入研究。
[0323]
实施例8瑞德西韦和gc376有效缓解estb中的sars-cov-2及变异株的 感染
[0324]
早期stbs易于被sars-cov-2高效感染，因此提供了一个正常生理情况 下的细胞模型用于评估抗sars-cov-2药物。为此，我们检测fda批准的抗病 毒药物瑞德西韦和另一个兽药gc376(ma，c.，sacco，m.d.，hurst，b.， townsend，j.a.，hu，y.，szeto，t.，zhang，x.，tarbet，b.，marty，m.t.， chen，y.，et al.(2020).boceprevir，gc-376，and calpain inhibitors ii，xiiinhibit sars-cov-2viral replication by targeting the viral main protease.cellresearch 30，678-692.)(图5a)。瑞德西韦在5μm浓度可以有效抑制sars
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cov-2对于vero e6细胞的侵染，ic50值为0.77um(wang et al，2020)。而在 estb，瑞德西韦抑制野生型sars-cov-2病毒载量ic50值为3.2
±
0.1nm；抑制 delta毒株ic50值为5.5
±
1.2nm，抑制omicron变异株的ic50值为4.1
±
1.5nm (图5b，图11a和s5b)。
[0325]
gc376是一个sars-cov-2主要蛋白酶的抑制剂，可以提高感染致死性 sars-cov-2病毒的小鼠的生存率(dampalla et al,2021)。gc376可以抑制 sars-cov-2及其变异株对于早期stb的感染(图5b和s5b)。gc376抑制野 生型sars-cov-2病毒载量的ic50值为31.2
±
5.6um；抑制delta毒株ic50值 为25.5
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3.2nm，抑制omicron变异株的ic50值为31.4
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4.1nm，这些数值远较 vero e6细胞。免疫荧光检测细胞中病毒n蛋白减少也证实上述作用(图11c)。
[0326]
在原始干细胞(stem cell)诱导的estb我们发现对三 种病毒株的抑制效应瑞德西韦和gc376的ic50值都是比较低(图11d)。表达 另一种高致病性病毒mers-cov宿主因子受体dpp4，在人围植入期胚胎与 ace2和enpep高度相关(qi et al,2020)也表达于estb(图11e)。从epsc 诱导的stb对于mers-cov的感染效率类似于vero e6细胞(de wilde etal,2013)。瑞德西韦和gc376都可以有效抑制mers-cov在estb的复制，也 与vero e6细胞相似(图11f)。这些数据提示，estb细胞可以作为针对 sars-cov-2，mers-cov以及其他病毒的可能的抗病毒药物筛选评价的良好 模型。
[0327]
我们继而进行全基因组检测，结果提示两种药物都显著减少sars-cov-2 相关基因(e、m、n、s)的表达(图5c)，而且两种药物都不会导致宿主内 在免疫反应的相关基因的变化，比如mda5、ifnl1-4、ifn-β和osl1。而在 药物处理组，前炎症因子基因比如tnf、il-6和il-8都显著下调(图5c、图 11g)。
[0328]
因为图4i已经显示出sars-cov-2感染对于stb的损害，我们实验继续 评估瑞德西韦和gc376抑制病毒感染是否会减轻病毒对于stb分化的损害， 发现药物作用后确实可以使stb的改变趋向类似于向空白对照stb(图11h)。 药物处理后，上调和下调基因的数目在药物处理的感染组较未做药物处理的感 染组减少(图5d)。另外，基于全基因组的机器学习分析结果提示，瑞德西韦 和gc376对于感染的早期stb的处理，使从pi-tb向pi-stb发育的伪时间路 径更接近正常对照，提示了抗病毒药物处理可以部分挽救病毒感染对stb发育 和分化的损害(图5e)。
[0329]
实施例9从epsc-tsc直接构建胎盘类器官模型并进行新冠病毒的感染实 验
[0330]
类器官，可以自我更新并展现出与在体发育和疾病相似的生理相关性，可 以作为离体研究covid-19极为有利的平台。已经有多种类器官模型，特别时 呼吸道细胞的类器
官，在新冠病毒感染中被深入的研究报道过(hanetal,2022)有报道从早期胎盘组织和囊胚可以建立长期遗传稳定的胎盘类器官，其生长及结构非常类似于在体胎盘的绒毛结构(haider，s.，meinhardt，g.，saleh，l.，kunihs，v.，gamperl，m.，kaindl，u.，ellinger，a.，burkard，t.r.，fiala，c.，pollheimer，j.，etal.(2018).self-renewingtrophoblastorganoidsrecapitulatethedevelopmentalprogramoftheearlyhumanplacenta.stemcellreports11，537-551.)。最近也有报道htscs的3d培养或者形成的类器官较2d的htscs更接近在体的胎盘结构(sheridan，m.a.，zhao，x.，fernando，r.c.，gardner，l.，perez-garcia，v.，li，q.，marsh，s.g.e.，hamilton，r.，moffett，a.，andturco，m.y.(2021).characterizationofprimarymodelsofhumantrophoblast.development148.)。既然观察到早期stbs对于sars-cov-2病毒高度敏感，这促使我们深入研究3d胎盘类器官细胞模型是否可以用于研究sars-cov-2感染。
[0331]
将epsc-tscs在已发表的培养条件下(sheridanetal,2020)分化建立胎盘类器官，htscs单细胞培养几天后聚集成小的簇状结构，并在20天左右逐步成熟形成3d类器官(图6a)。将这些类器官机械性的分离、传代，然后维持这样至少10代，发现它们组建成绒毛样结构，非常类似那些源于胎盘的结构(haider，s.，meinhardt，g.，saleh，l.，kunihs，v.，gamperl，m.，kaindl，u.，ellinger，a.，burkard，t.r.，fiala，c.，pollheimer，j.，etal.(2018).self-renewingtrophoblastorganoidsrecapitulatethedevelopmentalprogramoftheearlyhumanplacenta。stemcellreports11，537-551.)：基底膜侧是围绕在外围的基质胶接触，而合胞体的那些部分环绕中心腔体(图6b)。成熟的多核stb细胞阳性表达cgb和endon，位于类器官的内部且不表达干性转录因子gata3、tfap2a和tfap2c及早期stb标记cd46(图6c、图12b)
[0332]
滋养层细胞类器官其实汇聚了既有干性细胞也有stb(haider，s.，meinhardt，g.，saleh，l.，kunihs，v.，gamperl，m.，kaindl，u.，ellinger，a.，burkard，t.r.，fiala，c.，pollheimer，j.，etal.(2018).self-renewingtrophoblastorganoidsrecapitulatethedevelopmentalprogramoftheearlyhumanplacenta.stemcellreports11，537-551.)；表达htscs和stbs标记包括gata3、itga6、tead4和ervw-1、cgb。尽管与单纯的htscs或纯粹的stb相比，胎盘类器官这些基因的表达还是比较弱(图6d、图12c)，然而elisa可以在胎盘类器官上清中检测到成熟的β-hcg激素分泌(图12d)。与新近的一个研究(sheridan，m.a.，zhao，x.，fernando，r.c.，gardner，l.，perez-garcia，v.，li，q.，marsh，s.g.e.，hamilton，r.，moffett，a.，andturco，m.y.(2021).characterizationofprimarymodelsofhumantrophoblast.development148.)类似，我们建立的3d胎盘类器官较2d的epsc-tscs表达高水平的滋养层特异性microrna(has-mir-517a，525-3p)(图12e)。尽管胎盘类器官并不表达非常高的evt基因水平，它们仍然能够被高效地诱导为hla-g阳性和itga5阳性的强侵袭力的evt细胞(图12f-g)，证实了这些类器官细胞是双向潜能的干细胞。
[0333]
转录组分析进一步提示，epsc-tscs来源的胎盘类器官(epsc-orgs)与胎盘ct-tscs来源的胎盘类器官类似(ct-tsc-orgs)(图6e)(sheridan，m.a.，zhao，x.，fernando，r.c.，gardner，l.，perez-garcia，v.，li，q.，marsh，s.g.e.，hamilton，r.，moffett，a.，andturco，m.y.(2021).characterizationofprimarymodelsofhuman
trophoblast.development 148.)。对tsc和stb差异基因分析提示，epsc-orgs显示了与两者相似的标 志基因的共表达。
[0334]
为了研究胎盘类器官对于sars-cov-2病毒的易感性，我们检测了ace2 和tmprss2表达，发现epsc-orgs的ace2表达与epsc-tsc的表达水平 接近，但tmprss2在epsc-orgs表达却显著降低(图6g)，这与胎盘组织 相似。epsc-tsc来源的诱导20天的类器官在sars-cov-2病毒为10moi的 情况下(基于已有的在类器官感染病毒的条件(zhang et al,2020)，病毒在上清 液复制拷贝数与epsc-tsc感染病毒的产量相当(图6g)。免疫荧光检测发现 sars-cov-2 n蛋白出现于类器官的外围一小部分细胞中，在不同的类器官中 存在差异，可能与类器官的异质性有关。这些感染的细胞共表达ace2、cd46 和e钙粘蛋白，但并不表达cgb(图6h图12h)。尽管在2d培养的estb中 这些标志的共表达非常清晰(图3q)。体外情况下胎盘类器官对病毒的低感染 率支持了临床观察，即人体胎盘的sars-cov-2感染可以发生但并不常见 (male et al,2022,robert et al,2021)。
[0335]
基于上述实施例，至少可得出以下结论：
[0336]
(1)以ace2高表达为特征之一的早期合胞体滋养层细胞(estb)对冠 状病毒及其变异株高度易感；对抗病毒药物的易感性也较高。
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(2)早期合胞体滋养层细胞对冠状病毒及其变异株的易感性使其可以成 为冠状病毒及其变异株扩增的重要的人源细胞模型，这将大大提高病毒复制的 效能。利用早期stb进行病毒或其变异株的规模化扩增后，可为以人源性细胞 进行病毒扩增和加工改造提供重要的细胞来源，从而产生巨大的经济效益和社 会效益。
[0338]
(3)利用早期合胞体滋养层细胞高效扩增的病毒及其附属元件(例如表 面蛋白、病毒rna、细胞核抗原等)可用于制备疫苗。因这种细胞有别于目前 用于疫苗研发的动物类或其他类别的细胞，可提供人体作为宿主细胞用于病毒 复制的条件，用于生产与人体宿主细胞原件更为贴近的冠状病毒及其附属元件。 如所制备出来的灭活病毒疫苗等可具有较小的免疫原性，因而减少目前疫苗存 在的毒副作用等，从而产生巨大的经济效益和社会效益。
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(4)利用早期合胞体滋养层细胞(estb)对以ace2和/或dpp4为受体 的病毒及其变异株的高度易感特性，可以进行以ace2或dpp4为受体的病毒 感染的检测和科学研究，因此，早期stb可以作为病毒检测的重要手段加以广 泛开发和应用，从而产生巨大的社会和经济效益。
[0340]
(5)早期合胞体滋养层细胞(estb)对抗病毒药物的易感性也较高，因 此可以用于构建抗病毒药物检测、筛选、鉴定和创新药物研发的重要细胞模型/ 平台，所筛选的抗病毒新药或药物成分将产生巨大的经济效益和社会效益。
[0341]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这 些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
技术特征：1.人源胚外滋养层细胞模型在病毒制备中的应用。2.人源胚外滋养层细胞模型在制备预防病毒的疫苗中的应用。3.人源胚外滋养层细胞模型在检测病毒中的应用。4.人源胚外滋养层细胞模型在制备和/或筛选病毒疾病治疗药物中的应用。5.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型由人体胚外早期细胞诱导分化而得；所述人体胚外早期细胞包括人滋养层干细胞或人滋养层前体细胞，或可形成上述细胞的人源干细胞或人体早期胚胎组织分离的细胞。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述人源干细胞为人源早期干细胞、人源早期干细胞经基因编辑或组织工程改造的细胞亚系、体细胞重编程诱导的早期干细胞及其基因编辑或工程改造细胞亚系；人体早期胚胎组织分离的细胞为人源胎盘组织分离的细胞、人源胎盘组织分离的细胞经基因编辑或组织工程改造的细胞亚系。7.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型，所述早期合胞体滋养层细胞满足(1)～(4)中任一个或多个条件的细胞：(1)处于胚外分化早期的，高表达ace2的细胞；(2)处于胚外分化早期的，单核或双核的细胞；(3)处于胚外分化早期的，高表达cd46和/或ssea4的细胞；(4)处于胚外分化早期的，不表达或低表达cgb，和/或不分泌或低分泌β-hcg的细胞。8.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒为以ace2为受体介导入胞的病毒，和/或以dpp4为受体介导入胞的病毒。9.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒为sars-cov病毒；和/或sars-cov病毒的变异株；和/或mers-cov病毒；和/或mers-cov病毒的变异株。10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型；所述早期合胞体滋养层细胞模型作为高效复制、扩增和生产病毒的工具细胞。11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，病毒的制备方法包括：(1)制备早期合胞体滋养层细胞；(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞；(3)收集细胞上清液和细胞裂解液，进行病毒的提取和纯化。12.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型为早期合胞体滋养层细胞模型；所述早期合胞体滋养层细胞模型所复制或扩增生产的病毒进行疫苗的生产。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括：(1)制备早期合胞体滋养层细胞；(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞，病毒扩增和收集、纯化；(3)利用步骤(2)处理后的病毒，制得疫苗。14.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型为早期合胞
体滋养层细胞模型。15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，病毒检测方法包括：(1)制备早期合胞体滋养层细胞；(2)采用待检测样品感染早期合胞体滋养层细胞；(3)收集细胞上清液和细胞裂解液，进行病毒检测和鉴定。16.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病毒疾病包括由冠状病毒引起的疾病、冠状病毒与其他病毒疾病合并感染的疾病；所述应用包括利用合胞体滋养层细胞模型对已有药物和/或未知药物的筛选、测试和鉴定。17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的筛选包括利用早期合胞体滋养层细胞模型测试、比较和鉴定药物浓度/剂量的有效性、药物敏感性人群、药物毒性、药物的致癌作用和致畸作用。18.如权利要求16或17所述的应用，其特征在于，抗病毒药物检测和筛选的方法为：(1)制备早期合胞体滋养层细胞；(2)采用病毒株感染早期合胞体滋养层细胞；(3)抗病毒药物以不同剂量施加于感染病毒后的早期合胞体滋养层细胞，检测细胞生长活力，测定病毒载量，确定药物抑制病毒的效应。19.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人源胚外滋养层细胞模型的制备方法为：(1)提供/制备人体胚外早期细胞；(2)将所述人体胚外早期细胞分化诱导筛选得到早期合胞体滋养层细胞；(3)鉴定、制备和扩增早期合胞体滋养层细胞。
技术总结本发明公开一种人源胚外滋养层细胞模型在病毒高效制备、检测和药物筛选中的应用，属于细胞模型应用领域。具体的，本发明采用早期人体细胞诱导分化及筛选获得了胚外早期合胞体滋养层细胞(eSTB)模型。试验证明，胚外早期合胞体滋养层细胞(eSTB)模型在制备、检测冠状病毒及其变异株、制备预防冠状病毒及其变异株的疫苗以及制备、筛选冠状病毒及其变异株的治疗药物方面具有重要的应用价值。疗药物方面具有重要的应用价值。疗药物方面具有重要的应用价值。
技术研发人员：刘澎涛 阮德功 刘芳
受保护的技术使用者：干细胞转化研究中心有限公司
技术研发日：2022.06.06
技术公布日：2022/11/1
