本发明属于生物技术和生物分析领域，具体涉及一种人fgf21兔源单克隆抗体及其应用。
背景技术：
1、fgf21是一种重要的调控糖和脂质代谢生长因子。临床研究发现在代谢综合征患者和胰岛素抵抗个体中，血液fgf21水平明显升高[1]。fgf21作为生物标志物可以用于疾病诊断(与以下疾病正相关：2型糖尿病、糖尿病肾病、2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝等[2-5]；与以下疾病负相关：周边动脉阻塞性疾病(pad))，并可用于疾病风险评估(如糖尿病前期预期疾病进展风险)[6]。以2型糖尿病为例，研究表明血浆fgf21水平在糖尿病前期和糖尿病患者中显著升高，来源于无糖尿病个体的研究表明正常人血浆fgf21水平可预测人类糖尿病的发展[2-3]。血液fgf21水平在临床上也可以作为用药指导、疗效及风险预测的分子标志物，例如他汀类药物治疗患者心血管疾病事件预测[7]，也可以作为包括2型糖尿病病人不良心血管事件的预测因子[8]。
2、血液fgf21水平在健康管理上也有应用价值，血清fgf21水平与甘油三酯水平、收缩压、舒张压、脉压、体重指数(bmi)、年龄、空腹血糖(fpg)和总胆固醇水平显著相关，可以作为代谢紊乱的生物标志物[9]，在三高管理、饮食管理、青少年肥胖与脂肪肝肥胖管理和成年区域性骨矿化密度(负相关)等健康管理相关指标上有指导意义[10-12]。
3、此外，在细胞层面，fgf21也调控着细胞命运，研究发现fgf21与干细胞的衰老也相关，高表达fgf21可以抑制干细胞衰老表型[13]。
4、综上，fgf21不仅影响个体代谢和健康，也在微观层面影响细胞表型，同时也是药物开发的热门蛋白[14]。然而，fgf21目前还缺乏标准化的检测方法[15]。公开号为cn112005119a的专利公开了一种利用鼠源单克隆抗体检测和定量fgf21的方法，其按照未优化前的酶联免疫吸附(elisa)测定fgf21含量时，灵敏度为5pg/ml；对elisa测定优化后，灵敏度可提高至最优的2pg/ml，并且根据该专利记载，若想要进一步提高灵敏度，则需要借助quanterix simoa hd-1analyzertm的单分子检测仪器进行单分子免疫测定，但单分子检测价格更贵且普及性不及酶联免疫检测，同时该专利申请所述分析方法缺乏准确性和精密性数据支撑。
5、因此，目前仍需要开发准确性、精密性、灵敏度更好的fgf21检测试剂和方法，特别是能够更加精准识别人fgf21抗原表位的兔源单克隆抗体未见报道，本发明着力解决这个问题以满足fgf21生物学功能研究及药物开发、诊断试剂等开发需求。
6、参考文献：
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21、15.中国女医师协会糖尿病专业委员会，《糖尿病高危人群筛查及干预专家共识》，2022。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种人fgf21兔源单克隆抗体，用于满足分析方法学要求的准确、精密、灵敏度高地分析检测人fgf21蛋白生物样品。
2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、本发明第一方面提供了一种人fgf21兔源单克隆抗体，其包括第一单克隆抗体或第二单克隆抗体，其中：所述第一单克隆抗体包括：
4、(1)重链可变区cdr1，其包含氨基酸序列gidlssna及其保守置换；
5、(2)重链可变区cdr2，其包含氨基酸序列igitgnr及其保守置换；
6、(3)重链可变区cdr3，其包含氨基酸序列vrgvisdningi及其保守置换；
7、(4)轻链可变区cdr1，其包含氨基酸序列qslydnw及其保守置换；
8、(5)轻链可变区cdr2，其包含氨基酸序列kvs及其保守置换；
9、(6)轻链可变区cdr3，其包含氨基酸序列aggysgniha及其保守置换；
10、所述第二单克隆抗体包括：
11、(1)重链可变区cdr1，其包含氨基酸序列gfslssyr及其保守置换；
12、(2)重链可变区cdr2，其包含氨基酸序列itssgnt及其保守置换；
13、(3)重链可变区cdr3，其包含氨基酸序列aretydnygsrfni及其保守置换；
14、(4)轻链可变区cdr1，其包含氨基酸序列qsissy及其保守置换；
15、(5)轻链可变区cdr2，其包含氨基酸序列aas及其保守置换；
16、(6)轻链可变区cdr3，其包含氨基酸序列qsnflittygga及其保守置换。
17、根据一些具体实施方式，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体的重链恒定区包含seq id no:1的氨基酸序列及其保守置换，轻链恒定区包含seq id no:2的氨基酸序列及其保守置换。
18、根据一些具体实施方式，编码所述重链恒定区的核苷酸序列为seq id no:3及其同义核苷酸序列，编码所述轻链恒定区的核苷酸序列为seq id no:4及其同义核苷酸序列。
19、根据一些具体实施方式，所述第一单克隆抗体包括重链和轻链，其中，所述重链包含seq id no:5的氨基酸序列及其保守置换，所述轻链包含seq id no:6的氨基酸序列及其保守置换。
20、根据一些具体实施方式，编码所述第一单克隆抗体重链的核苷酸序列为seq idno:7及其同义核苷酸序列，编码所述第一单克隆抗体轻链的核苷酸序列为seq id no:8及其同义核苷酸序列。
21、根据一些具体实施方式，所述第二单克隆抗体包括重链和轻链，其中，所述重链包含seq id no:9的氨基酸序列及其保守置换，所述轻链包含seq id no:10的氨基酸序列及其保守置换。
22、根据一些具体实施方式，编码所述第二单克隆抗体重链的核苷酸序列为seq idno:11及其同义核苷酸序列，编码所述第二单克隆抗体轻链的核苷酸序列为seq id no:12及其同义核苷酸序列。
23、根据一些具体实施方式，所述人fgf21兔源单克隆抗体通过如下步骤制备得到：
24、(1)人fgf21蛋白抗原表达纯化；
25、(2)用人fgf21蛋白抗原对兔进行多次动物免疫；
26、(3)分离兔脾脏pbmc，流式细胞仪筛选羊抗兔igg-fitc和fgf21-af647双阳性细胞并培养；
27、(4)将阳性克隆细胞进行测序，测序确认正确后扩增质粒转染cho细胞，培养纯化，收集所述人fgf21兔源单克隆抗体。
28、本技术通过兔源单克隆抗体筛选比较，筛选出了elisa信号高的单克隆抗体，并通过组合配对筛选优化，得到了一对信号水平最高的克隆(25pg/ml fgf21 elisa检测od值大于1)，可用于人fgf21生物样品的定量分析。
29、本发明第二方面提供一种试剂盒，其包括捕获抗体和检测抗体，其中，所述捕获抗体为如上所述的第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的一种，所述检测抗体为如上所述的第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的另一种。
30、根据一些具体实施方式，所述捕获抗体为所述第一单克隆抗体，所述检测抗体为所述第二单克隆抗体。
31、根据一些具体实施方式，所述试剂盒还包括免疫标记物、能够与免疫标记结合且能够催化底物显色的酶的复合物和能够被所述酶催化显色的底物。其中，所述免疫标记物包括但不限于生物素、fitc等。所述酶的复合物包括不限于偶联酶的链霉亲和素。所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶等。所述底物包括但不限于tmb显色液、opd显色液等。
32、根据一些具体实施方式，所述检测抗体与生物素缀合。根据一些具体实施方式，所述试剂盒包括但不限于酶联免疫试剂盒。
33、根据一些具体实施方式，所述试剂盒的待测样品可以为各类生物样品，包括但不限于血液、痰液、唾液、胸腔积液、胸/腹水、脑脊液、支气管/肺部灌洗液、分泌物(如鼻咽部分泌物)、排泄物(如尿、粪)、细胞培养上清液等。其中，血液可以为全血、血浆、血清等。
34、根据一些具体实施方式，所述试剂盒的待测样品是血浆样品。
35、根据一些具体实施方式，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。本技术可以克服elisa检测容易存在信号弱、仪器读数低和灵敏度不够的问题，本技术的试剂盒elisa检测信号强，酶标仪读数值高，标准曲线拟合相关系数高，准确度、精密度和灵敏度高，方便样品分析检测。
36、根据一些具体实施方式，所述捕获抗体的浓度为0.1-1μg/ml，例如0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.55μg/ml、0.6μg/ml、0.65μg/ml、0.7μg/ml、0.75μg/ml、0.8μg/ml、0.85μg/ml、0.9μg/ml、0.95μg/ml或1μg/ml。
37、根据一些具体实施方式，所述检测抗体的浓度为0.05-0.5μg/ml，例如0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.07μg/ml、0.08μg/ml、0.09μg/ml、0.1μg/ml、0.11μg/ml、0.15μg/ml、0.2μg/ml、0.25μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml或0.5μg/ml。
38、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
39、本发明的人fgf21兔源单克隆抗体，制备方便，表达量(72ml可纯化3mg左右的抗体)和效价(效价大于50000)高。采用本发明的人fgf21兔源单克隆抗体，仅使用简单通用的双抗夹心elisa方法即可实现满足生物分析方法学要求的高灵敏度、高准确性和高精密性的fgf21生物样品分析，本发明的抗体相对于鼠单克隆抗体识别抗原表位更加精准，亲和力和稳定性更高，elisa抗体使用量低，性价比高。
1.一种人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：其包括第一单克隆抗体或第二单克隆抗体，其中：
2.根据权利要求1所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体的重链恒定区包含seq id no:1的氨基酸序列及其保守置换，轻链恒定区包含seq id no:2的氨基酸序列及其保守置换。
3.根据权利要求1或2所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：编码所述重链恒定区的核苷酸序列为seq id no:3及其同义核苷酸序列，编码所述轻链恒定区的核苷酸序列为seq id no:4及其同义核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：所述第一单克隆抗体包括重链和轻链，其中，所述重链包含seq id no:5的氨基酸序列及其保守置换，所述轻链包含seq id no:6的氨基酸序列及其保守置换。
5.根据权利要求1或4所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：编码所述第一单克隆抗体重链的核苷酸序列为seq id no:7及其同义核苷酸序列，编码所述第一单克隆抗体轻链的核苷酸序列为seq id no:8及其同义核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：所述第二单克隆抗体包括重链和轻链，其中，所述重链包含seq id no:9的氨基酸序列及其保守置换，所述轻链包含seq id no:10的氨基酸序列及其保守置换。
7.根据权利要求1或6所述的人fgf21兔源单克隆抗体，其特征在于：编码所述第二单克隆抗体重链的核苷酸序列为seq id no:11及其同义核苷酸序列，编码所述第二单克隆抗体轻链的核苷酸序列为seq id no:12及其同义核苷酸序列。
8.一种试剂盒，其特征在于：其包括捕获抗体和检测抗体，其中，所述捕获抗体为权利要求1至7中任一项所述的第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的一种，所述检测抗体为权利要求1至7中任一项所述的第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的另一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获抗体为所述第一单克隆抗体，所述检测抗体为所述第二单克隆抗体。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
