本发明涉及生物，具体涉及拉沙病毒包膜糖蛋白gp突变体及其在制备拉沙疫苗中的应用。
背景技术：
1、拉沙热(lassa fever，lf)为拉沙病毒(lassa virus，lasv)感染导致的急性病毒性出血热，临床表现主要为发热、寒战、咽炎、胸骨后疼痛和蛋白尿，可出现多系统病变，病死率可高达50％。目前尚无已批准上市的lf疫苗，因此，亟需研发针对lasv的疫苗。
2、自然感染条件下，人和非人灵长类动物感染lasv后，无论死亡病例还是康复者，均不能诱导有效的抗体应答，然而，在病毒急性感染的免疫应答中，中和抗体对中和病毒，阻断病毒感染具有十分重要的作用。现有研究表明，含有中和抗体的康复者血浆可以产生有效的动物保护效果。这提示诱导产生有效的中和抗体应答可以阻断lasv感染，从而达到预防感染的目的。此外，lasv具有高度遗传多样性，现已确认有四个谱系(ⅰ-ⅳ)，还有未广泛承认的三个谱系(ⅴ-ⅶ)，所以，诱导产生广谱的高活性中和抗体是高效lasv疫苗研究的主要方向。
3、目前，lasv疫苗研究主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、重组病毒载体疫苗、亚单位疫苗、病毒vlp疫苗和核酸疫苗，均采用lasv gp作为抗原。lasv减毒活疫苗可保护非人灵长类动物免受致死性lasv的攻击，但减毒疫苗不能忽视的毒力返祖等安全问题，阻碍了lasv减毒活疫苗走向临床。同时，lasv灭活疫苗免疫豚鼠后，能诱导一定的特异性抗体，但用致死性剂量的lasv对动物进行攻毒，动物虽然延迟了发病时间，但所有动物均死亡，所以灭活疫苗不能诱导产生针对lasv的完全保护。基于病毒载体的lasv疫苗目前研究较多，例如，表达lasv gp的黄热病毒载体可诱导产生特异性的抗体和低水平的中和抗体，但是该嵌合病毒复制率很低，且在细胞中不能稳定传代。表达lasv gp的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体，在假病毒攻击实验中具有一定的动物保护效果，但未检测到中和抗体应答。
4、综上所述，目前在研的以lasv gp作为抗原的lasv疫苗均未能诱导产生高水平中和抗体，因此，有必要对lasv gp进行改造，以得到能诱导机体产生高水平中和抗体的lasv疫苗抗原。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种在融合前构象gp基础上进行糖基化位点突变的lasv疫苗抗原设计策略，采用该策略设计lasv疫苗抗原免疫小鼠后，可诱导产生中和lasv假病毒的中和抗体，且促进小鼠引流淋巴结生发中心的形成，并高效诱导th1型细胞免疫应答，即在融合前构象gp基础上进行糖基化位点突变的lasv疫苗设计策略可诱导体液免疫应答，并产生中和抗体。
2、lasv gp是诱导中和抗体的主要抗原，本发明根据lasv gp基因序列，首先引入二硫键(r207c、g360c)和脯氨酸(e329p)形成融合前构象(pf)，在此基础上分别进行2个糖基化位点(n390d、n395d)突变(pf-nd2)，4个糖基化位点(n390d、n395d、n224d、n373d)突变(pf-nd4)，和4个糖基化位点与酶切位点联合突变(n390d、n395d、n224d、n373d和rrrr，pf-nd4-r4)，并分别插入真核表达载体pvax1，得到4种质粒抗原pf、pf-nd2、pf-nd4和pf-nd4-r4，蛋白免疫印迹(wb)鉴定以上质粒正确表达。
3、本发明进一步检测了上述4种质粒抗原免疫小鼠后，小鼠引流淋巴结生发中心的形成，t细胞免疫应答和血清中和抗体活性。结果表明质粒pf-nd4免疫后细胞免疫应答为th1型，且小鼠血清对lasv假病毒pvsv-lasv-nluc的中和活性高于其他组，即说明在融合前构象基础上进行4个糖基化位点突变的设计策略可诱导体液免疫应答和中和抗体。
4、因此，本发明的第一个目的是提供lasv gp蛋白突变体，所述lasv gp蛋白突变体是在序列如seq id no.1所示的野生型lasv gp全长序列上进行氨基酸突变修饰获得，所述lasv gp蛋白突变体为通过以下两种方式获得的任意一种：
5、(1)将seq id no.1第207位的精氨酸r突变为半胱氨酸c，第329位的谷氨酸e突变为脯氨酸p，第360位的甘氨酸g突变为半胱氨酸c，将第390位、395位、224位和373位的天冬酰胺n突变为天冬氨酸d；
6、(2)将seq id no.1第207位的精氨酸r突变为半胱氨酸c，第329位的谷氨酸e突变为脯氨酸p，第360位的甘氨酸g突变为半胱氨酸c，将第390位、395位、224位和373位的天冬酰胺n突变为天冬氨酸d，将第258和259位的亮氨酸l突变为精氨酸r。
7、进一步地，由(1)所述方式获得的lasv gp蛋白突变体的编码基因序列如seq idno.11所示。
8、进一步地，由(2)所述方式获得的lasv gp蛋白突变体的编码基因序列如seq idno.12所示。
9、本发明的第二个目的是提供一种生物材料，为下述(1)-(4)中至少一种：
10、(1)编码如权利要求1所述lasv gp蛋白突变体的核酸分子；
11、(2)含有(1)所述核酸分子的重组载体；
12、(3)含有(1)所述核酸分子的重组微生物或含有(2)所述重组载体的重组微生物；
13、(4)含有(1)所述核酸分子的重组细胞系或含有(2)所述重组载体的重组细胞系。
14、本发明的第三个目的是提供所述lasv gp蛋白突变体或所述生物材料在如下(1)-(3)任一种中的应用：
15、(1)制备抗lasv的产品；
16、(2)制备预防和/或治疗lasv感染的产品；
17、(3)制备预防和/或治疗lasv所致疾病的产品。
18、本发明的第四个目的是提供一种中和抗体诱导型lasv疫苗，其活性成分为所述lasv gp蛋白突变体或所述生物材料。
19、进一步地，所述疫苗为dna疫苗、mrna疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、纳米颗粒展示的重组蛋白亚单位疫苗或重组载体疫苗。。
20、进一步地，所述疫苗的制剂形式为水剂或冻干剂。
21、本发明的第五个目的是提供所述的疫苗在如下(1)-(3)任一种中的应用：
22、(1)制备抗lasv的产品；
23、(2)制备预防和/或治疗lasv感染的产品；
24、(3)制备预防和/或治疗lasv所致疾病的产品。
25、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
26、1、本发明中的抗原为质粒dna，可以直接表达原始构象病毒抗原、兼具内源性、外源性抗原提呈途径，受环境的影响小，生产成本较低，生产过程相对简单，可快速设计投产，便于临床及实验室的应用。
27、2、本发明检测了小鼠引流淋巴结生发中心的形成，t细胞免疫应答和血清中和抗体活性，结果显示在融合前构象基础上进行4个糖基化位点突变的设计策略可诱导体液免疫应答和中和抗体。
1.lasv gp蛋白突变体，其特征在于，所述lasv gp蛋白突变体是在序列如seq id no.1所示的野生型lasv gp全长序列上进行氨基酸突变修饰获得，所述lasv gp蛋白突变体为通过以下两种方式获得的任意一种：
2.根据权利要求1所述lasv gp蛋白突变体，其特征在于，由(1)所述方式获得的lasvgp蛋白突变体的编码基因序列如seq id no.11所示。
3.根据权利要求1所述lasv gp蛋白突变体，其特征在于，由(2)所述方式获得的lasvgp蛋白突变体的编码基因序列如seq id no.12所示。
4.一种生物材料，其特征在于，为下述(1)-(4)中至少一种：
5.权利要求1所述lasv gp蛋白突变体或权利要求5所述生物材料在如下(1)-(3)任一种中的应用：
6.一种中和抗体诱导型lasv疫苗，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述lasv gp蛋白突变体或权利要求4所述生物材料。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为dna疫苗、mrna疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、纳米颗粒展示的重组蛋白亚单位疫苗或重组载体疫苗。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制剂形式为水剂或冻干剂。
9.权利要求8所述的疫苗在如下(1)-(3)任一种中的应用：
