本发明涉及酶工程和生物，具体地，涉及一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体及其编码基因、一种重组载体，一种重组菌株，一种酶制剂以及它们在降解塑料及其中间体中的应用。
背景技术：
1、合成塑料自面世以来，因其可塑性以及稳定性被广泛应用到人类生活的诸多方面。目前，合成塑料主要包括两大类：聚酯类(聚对苯二甲酸乙二醇酯pet、聚氨酯pur)和聚烯烃类(聚乙烯pe、聚丙烯pp、聚苯乙烯ps、聚氯乙烯pvc)。由于合成塑料是由单体经加聚或缩聚反应而成的高分子化合物，具有结晶度高、疏水性强、理化性质稳定等特性，因此合成塑料的抗降解性非常强。废弃塑料在自然环境中分解缓慢，导致大量的塑料垃圾积聚在土地和海洋中，引起全球“白色”污染。
2、作为世界第四大聚合物，聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，pet)及其中间产物的的降解一直备受关注。目前对pet降解及的研究主要集中在高效解聚pet，而对pet的中间产物如2-羟乙基对苯二甲酸酯(bis-2-hydroxyethyl terephthalate，bhet)、单羟乙基对苯二甲酸酯(mono-2-hydroxyethyl terephthalate，mhet)的研究不多。与传统的物理化学法相比，酶法降解bhet具有反应步骤少，废弃物产生少，有利于环境保护，生产成本降低，产品杂质少、易分离且质量优异等诸多优点。因此，石油基塑料的酶法降解是塑料降解发展的趋势之一。
3、来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis pet-86)的2-羟乙基对苯二甲酸酯水解酶(bsest，ec3.1.1.1)又称为羧酸酯酶，是一种α/β水解酶。该酶具有良好的催化酯化/去酯化特性。在酶法水解2-羟乙基对苯二甲酸酯中，其主要在动力学控制下进行水解反应。在水解体系中主要存在以下2个反应：(1)bhet脱去eg水解为mhet；(2)mhet进一步脱去乙二醇(eg)水解为tpa。最终转化率取决于这两个反应之间的平衡。
4、现有的野生型2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶虽然其能够将2羟乙基对苯二甲酸酯(bis2hydroxyethyl terephthalate，bhet)水解为单羟乙基对苯二甲酸酯(mono2hydroxyethyl terephthalate，mhet)和对苯二甲酸(tpa)，但混合产物不利于后续的应用。因此，有必要对野生型2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶进行改造，将bhet定向水解为单一的产物。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶的定向性低、混合产物(mhet和tpa)不利于后续应用的问题，提供一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和酶制剂以及它们的应用，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体具有较高的产物选择性，能够将bhet定向降解为mhet，且活性不受ph条件的限制，具有优异的热稳定性。
2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体为将具有seq id no.2所示氨基酸序列的酶在第105位，第106位，第185位，第187位，第188位，第191位，第192位，第193位，第214位，第215位，第216位，第306位，第307位，第311位，第359位和第398位中的至少一位进行突变。
3、优选地，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体为将具有seq id no.2所示氨基酸序列的酶在第185位、第306位和第359位中的至少一位进行突变。
4、优选地，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体突变方式为t306d、t306h、t306q、t306d、t306h、t306q、t359d、t359k、t359n和t359q。
5、本发明第二方面提供一种编码2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的基因，该基因具有编码如前所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的核苷酸序列。
6、本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如前所述的基因。
7、本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有如前所述的基因或者如前所述的重组载体。
8、本发明第五方面提供一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的制备方法，该方法包括：将如前所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养。
9、本发明第六方面提供一种酶制剂，该酶制剂包含如前所述的方法制得的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体。
10、本发明第七方面提供如前所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体、如前所述的基因、如前所述的重组载体、如前所述的重组菌株、如前所述的方法制得的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体和如前所述的酶制剂中的至少一种在聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料中间体bhet的应用。
11、本发明第八方面提供如前所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体、如前所述的基因、如前所述的重组载体、如前所述的重组菌株、如前所述的方法制得的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体和如前所述的酶制剂中的至少一种在聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料中间体bhet的降解方法。
12、通过上述技术方案，本发明通过理性设计技术对来源自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)pet-86的野生型2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶进行突变，提供了多种新的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体，均可以实现将bhet 100％定向降解为mhet，而不会进一步降解为末端产物tpa，不仅提高了该水解酶的催化效率，且具有极高的产物选择性；酶解过程不受ph条件的限制，并具有较高的热稳定性。
13、本发明提供的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体在塑料及其中间物的降解中具有广阔的工业应用前景。
1.一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体，其特征在于，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体为将具有seq id no.2所示氨基酸序列的酶在第105位，第106位，第185位，第187位，第188位，第191位，第192位，第193位，第214位，第215位，第216位，第306位，第307位，第311位，第359位和第398位中的至少一位进行突变。
2.根据权利要求1所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体，其特征在于，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体为将具有seq id no.2所示氨基酸序列的酶在第185位、第306位和第359位中的至少一位进行突变。
3.根据权利要求2所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体，其特征在于，该2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体为将具有seq id no.2所示的氨基酸序列的酶进行(1)-(3)中至少一种所述的突变：
4.一种编码2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1-3中任意一项所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述的基因；
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求4所述的基因或者权利要求5所述的重组载体。
7.一种2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将权利要求6所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养。
8.一种酶制剂，其特征在于，该酶制剂包含权利要求7所述的方法制得的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体。
9.权利要求1-3中任意一项所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体、权利要求4所述的基因、权利要求5所述的重组载体及转化体、权利要求6所述的重组菌株、权利要求7所述的方法制得和纯化的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体和权利要求8所述的酶制剂中的至少一种在降解塑料及其中间体中的应用；优选为在将bhet降解为mhet中的应用。
10.一种bhet的降解方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-3中任意一项所述的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体、权利要求4所述的基因、权利要求5所述的重组载体及转化体、权利要求6所述的重组菌株、权利要求7所述的方法制得和纯化的2-羟乙基对苯二甲酸二酯水解酶突变体和权利要求8所述的酶制剂中的至少一种，与bhet接触；
