本发明涉及一种内切葡聚糖酶突变体，尤其涉及一种热稳定性提高的内切葡聚糖酶突变体，属于基因工程。
背景技术：
1、纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，是环境友好、可生物降解的天然有机高分子材料。纤维素及其衍生物广泛用于生物医药、食品、电子元件、新能源等诸多领域，其水解产物是酿酒工程、生产纸张和纺织品、生物燃料和化学品等的重要原料。作为植物细胞壁的主要结构成分，纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，因此对植物源产品的质地影响很大。例如在食品加工业中，纤维素的存在会降低果汁的提取率和品质，对生产效率和产品质量等造成负面影响。而在各种降解纤维素的方法中，利用纤维素酶的生物降解法凭借反应条件温和、环境友好等优点，成为与有关纤维素的工业生产中的关注焦点。
2、内切葡聚糖酶是一种重要的纤维素酶，能够随机剪切纤维素多糖链内部的无定形区域，水解糖苷键、打破纤维素链，产生不同长度的寡糖和新链的末端，在降解纤维素分子中发挥重要作用。不同来源的内切葡聚糖酶的酶学性质差异很大，目前已知的内切葡聚糖酶在高温条件下催化效率不高，无法满足工业生产的需求。中国发明专利cn 108048430a公开了一种内切葡聚糖酶nfeg12a突变体及其编码基因和应用，所述突变体的最适温度为65℃，在该温度下的催化效率比野生酶提高了0.5～0.8倍。中国发明专利cn 102443576a公开了一种内切葡聚糖酶的突变体及其编码基因与应用，所述突变体具有较宽的工作温度范围，最适温度为75℃且在该温度下的比活力高于野生型。具有更高热稳定性的内切葡聚糖酶能够在实际应用的复杂环境中保持更高效的催化性能。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的是提供一种热稳定性提高的内切葡聚糖酶突变体，并提供编码所述突变体的核酸分子、包含所述突变体的载体或重组细胞或产品，以及所述突变体的制备方法与应用。
2、技术方案：本发明的第一方面提供3种内切葡聚糖酶突变体，所述内切葡聚糖酶突变体的氨基酸序列由如seq id no.1所示序列经突变得到，所述突变为v217l或n264y或r170p/n264y。
3、本发明以地芽孢杆菌(geobacillus sp.70pc53)来源的内切葡聚糖酶作为原始酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。通过对原始酶进行人工定点突变，获得所述内切葡聚糖酶突变体。
4、本发明使用氨基酸的标准单字母与标准的取代记法：v217l意指n端第217位的缬氨酸(v)突变为亮氨酸(l)；r170p/n264y意指n端第170位的精氨酸(r)突变为脯氨酸(p)，并且n端第264位的天冬酰胺(n)突变为酪氨酸(y)。
5、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的内切葡聚糖酶突变体。所述核酸分子的核苷酸序列由如seq id no.2所示序列经碱基突变得到。
6、第三方面，本发明提供一种载体，包含第二方面所述的核苷酸序列。所述载体可以是克隆载体或表达载体。
7、第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包含第三方面所述的载体。
8、第五方面，本发明提供一种第一方面所述内切葡聚糖酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)设计点突变引物，以包含seq id no.2核苷酸序列的质粒为模板，进行pcr反应，用内切酶消化模板，再将消化产物重组得到带有突变基因的表达载体；(2)将所述表达载体转入宿主菌进行发酵表达；(3)收集宿主菌破碎细胞，离心取上清即获得内切葡聚糖酶突变体。
9、第六方面，本发明提供一种产品，所述产品包含第一方面所述的内切葡聚糖酶突变体或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体或第四方面所述的重组细胞。
10、第七方面，本发明提供一种第六方面所述产品在催化纤维素水解中的应用。所述催化的温度为65℃～95℃。
11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、本发明提供的内切葡聚糖酶突变体热稳定性优于原始酶，经95℃处理后，突变体相比原始酶的残留酶活可提高217％；2、本发明提供的内切葡聚糖酶突变体在65℃～95℃内的相对酶活均高于原始酶，能够在更高且更广的温度范围内保持良好的催化性能，工业应用前景较好。
1.一种内切葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述内切葡聚糖酶突变体的氨基酸序列由如seq id no.1所示序列经突变得到，所述突变为v217l或n264y或r170p/n264y。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的内切葡聚糖酶突变体。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列由如seqid no.2所示序列经碱基突变得到。
4.一种载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为克隆载体或表达载体。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求4所述的载体。
7.一种权利要求1所述内切葡聚糖酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计点突变引物，以包含seq id no.2核苷酸序列的质粒为模板，进行pcr反应，用内切酶消化模板，再将消化产物重组得到带有突变基因的表达载体；（2）将所述表达载体转入宿主菌进行发酵表达；（3）收集宿主菌，破碎细胞，离心取上清即获得内切葡聚糖酶突变体。
8.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的内切葡聚糖酶突变体或权利要求2～3任一项所述的核酸分子或权利要求4所述的载体或权利要求6所述的重组细胞。
9.一种权利要求8所述产品在催化纤维素水解中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述催化的温度为65℃~95℃。
