本发明涉及免疫诊断，具体涉及一种微球与蛋白偶联的方法。
背景技术：
1、纳米微球一般是高分子聚合而成，例如聚苯乙烯，壳聚糖、聚丙烯酸、二氧化硅等材料聚合成纳米级别的微球。纳米微球被广泛应用到体外诊断试剂中，纳米微球通常通过化学键结合、物理吸附以及生物亲和等方式偶联蛋白。其中，化学键结合方式主要是通过在纳米微球表面修饰一些反应基团，例如羧基、羟基、醛基等，再通过活化剂，例如edc、nhs、戊二醛、nabh3cn等活化剂将反应基团活化，再与抗体/抗原上的氨基进行化学键结合，即微球与抗体/抗原进行偶联，之后再用带有特定基团的化学物质对未进行偶联的多余结合位点进行封闭。物理吸附法是通过纳米微球与蛋白之间的非特异性相互作用，如静电吸附、疏水相互作用等，实现两者的偶联。生物亲和法利用生物分子之间的特异性识别作用，如抗原和抗体反应、生物素和亲和素系统等，实现纳米微球与蛋白的偶联。
2、采用化学方法进行偶联时，为了实现免疫反应后的检测需求，纳米微球中会通过包埋法、自组装法、化学键合法、共聚法等方法吸附或包埋荧光染料分子、光敏剂等化学物质。而这些有机物质通常有较强疏水性，即使纳米微球表面修饰有亲水基团，也可能在偶联抗体过程中因为出现团聚、沉降的现象。由于物理吸附的作用力相对较弱，在外界环境的影响下，如温度、离子强度的变化，容易导致纳米微球与蛋白的团聚。采用生物亲和法中所使用的特异性生物分子，如抗体、亲和素等，通常制备成本较高，这增加了整个偶联过程的经济成本，不适用于生产应用。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种微球与蛋白偶联的方法，本发明提供的一种微球与蛋白偶联的方法能够改善标记过程中的微球的分散性，从而提高微球标记的抗体/抗原数量的效果。
2、本发明提供了一种微球与蛋白偶联的方法，包括如下步骤：
3、步骤1、取微球与清洗液混合后超声清洗；
4、步骤2、取步骤1中清洗后的微球进行活化；
5、步骤3、取活化后的微球与清洗液混合后，再次超声清洗；
6、步骤4、取步骤3中清洗后的微球与蛋白混合进行偶联反应；
7、步骤5、取步骤4中偶联后的微球，经封闭，获得微球与蛋白的偶联物；
8、所述清洗液包括十二烷基苯磺酸钠和胆酸钠。
9、与现有技术相比，本发明提供的微球与蛋白偶联的方法各步骤之间相互影响，各组分溶液之间相互配合，改善标记过程中的微球的团聚、沾壁现象，达到提高微球标记的抗体或抗原数量的目的，从而可以节约抗体或抗原成本，以达到更好的技术效果。
10、在一些实施例中，每100ml所述清洗液中包含0.0001~0.01g十二烷基苯磺酸钠和0.0001~0.01g胆酸钠。
11、与现有技术中的清洗液相比，本发明提供的清洗液能够更好的改善标记过程中的微球的团聚、沾壁现象，从而获得更准确的技术效果。上述浓度范围的清洗液中，组分之间相互配合效果更好，兼容性更强，能够更好的改善标记过程中的微球的团聚、沾壁现象，从而获得更准确的技术效果。
12、在一些具体实施例中，每100ml所述清洗液中包含0.01g十二烷基苯磺酸钠和0.0001g胆酸钠。
13、在一些具体实施例中，每100ml所述清洗液中包含0.0001g十二烷基苯磺酸钠和0.01g胆酸钠。
14、在一些具体实施例中，每100ml所述清洗液中包含0.005g十二烷基苯磺酸钠和0.005g胆酸钠。
15、实验表明，在上述浓度下，所述清洗液组分之间配合最好，兼容性最强，从而获得最准确的技术效果。
16、在一些实施例中，所述微球包括荧光微球、供体微球和受体微球中的至少一种。
17、优选地，所述微球的原料包括聚苯乙烯、壳聚糖、聚丙烯酸和二氧化硅中的至少一种，
18、优选地，所述微球的表面标记物包括荧光、放射性同位素、酶、生物素、抗体和化学发光基团中的至少一种。
19、更优选地，所述微球为受体微球。
20、在一些实施例中，所述超声清洗后还包括将所述微球进行离心并弃上清；
21、优选地，所述离心的速度为10000~20000rpm，所述离心的时间为10~15min；
22、更优选地，所述离心的速度为18000rpm，所述离心的时间为15min。
23、在一些实施例中，所述步骤2中，所述活化包括取所述微球、稀释液和所述活化剂混合、震荡孵育。
24、在一些实施例中，所述活化剂包括edc、nhs、戊二醛和nabh3cn中的至少一种，所述稀释液包括mes缓冲液、hepes缓冲液和pbs缓冲液中的至少一种。
25、优选地，所述活化的反应温度为25~40℃，所述震荡孵育采用500~1000rmp孵育15~30min；
26、所述活化的反应温度为30℃，所述震荡孵育采用800rmp孵育30min。
27、在一些实施例中，所述步骤4中，所述偶联反应包括取偶联缓冲液悬浮所述经清洗后的微球后，与所述蛋白混合、震荡孵育，所述偶联缓冲液包括hepes缓冲液、pbs缓冲液和硼酸缓冲液中的至少一种，所述蛋白包括抗体或抗原；
28、优选地，所述孵育的溶液中，所述微球的浓度为30~70%（w/v），所述蛋白的浓度为1%~30%（w/v），所述孵育的温度为25~40℃，所述震荡孵育采用500~1000rmp震荡孵育2~4h；
29、更优选地，所述孵育的溶液中，所述微球的浓度为50%（w/v），所述蛋白的浓度为30%（w/v），所述孵育的温度为30℃，所述震荡孵育采用800rmp震荡孵育4h。
30、在一些实施例中，所述步骤5中，所述封闭包括取所述微球经封闭液震荡孵育，所述封闭液包括bsa、甘氨酸、乙醇胺、酪蛋白和羧基甲氧基胺中的至少一种；
31、优选地，所述封闭的反应温度为25~40℃，所述封闭采用500~1000rmp震荡孵育15~30min；
32、更优选地，所述封闭的反应温度为30℃，所述封闭采用800rmp震荡孵育30min。
33、在一些实施例中，所述封闭后的溶液经离心、弃上清后，采用水再次超声清洗、离心，所得沉淀与缓冲液混合保存，所述缓冲液包括tris缓冲液、hepes缓冲液和pbs缓冲液中的至少一种；
34、优选地，所述保存的温度为2~8℃
35、更优选地，所述保存的温度为4℃。
36、实验表明，对比现有技术中的微球和蛋白的偶联物，采用上述方法制得的偶联物，由于其各步骤之间相互影响效果最好，各组分溶液之间相互配合最紧密，能够更好的改善标记过程中的微球的团聚、沾壁现象，达到更好的微球标记的抗体或抗原数量的目的，从而可以节约抗体或抗原成本，从而获得更准确的技术效果。
37、本发明提供了采用所述的方法制得的偶联物。
38、本发明提供了所述的偶联物在制备检测试剂盒中的应用。
39、本发明提供了检测试剂盒，包括所述的偶联物。
40、本发明提供了检测方法，包括采用所述检测试剂盒对样本进行检测。
41、本发明提供了一种微球与蛋白偶联的方法，能够改善标记过程中的微球的分散性，改善标记过程中的微球的团聚、沾壁现象，使微球活化、偶联时均处于分散性良好的状态，从而提高活化效率、偶联效率，达到提高微球标记的抗体/抗原数量的效果，从而可以节约抗体/抗原成本，本发明的方法应用于制备检测试剂盒时，能够有效提高试剂的检测灵敏度。
1.一种微球与蛋白偶联的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每100ml所述清洗液中包含0.0001~0.01g十二烷基苯磺酸钠和0.0001~0.01g胆酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述微球包括荧光微球、供体微球和受体微球中的至少一种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1和步骤3中，所述超声清洗后还包括取所述微球离心并弃上清，所述离心的速度为10000~20000rpm，所述离心的时间为10~15min。
5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述活化包括取所述微球和所述稀释液超声混匀后，再加入活化剂混合、震荡孵育。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述活化剂包括edc、nhs、戊二醛和nabh3cn中的至少一种，所述稀释液包括mes缓冲液、hepes缓冲液和pbs缓冲液中的至少一种；
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，所述偶联反应包括取偶联缓冲液悬浮所述经清洗后的微球后，与所述蛋白混合、震荡孵育。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述偶联缓冲液包括hepes缓冲液、pbs缓冲液和硼酸缓冲液中的至少一种，所述蛋白包括抗体或抗原；
9.根据权利要求1~8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5中，所述封闭包括取所述微球经封闭液震荡孵育，其中，所述封闭液包括bsa、甘氨酸、乙醇胺、酪蛋白和羧基甲氧基胺中的至少一种，所述封闭的反应温度为25~40℃，所述封闭采用500~1000rmp震荡孵育15~30min。
10.根据权利要求1~9任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭后的溶液经离心、弃上清后，采用水再次超声清洗、离心，所得沉淀与缓冲液混合保存，其中，所述缓冲液包括tris缓冲液、hepes缓冲液和pbs缓冲液中的至少一种，所述保存的温度为2~8℃。
