本发明涉及微生物领域，具体涉及一种改善参地土壤健康状况的方法。
背景技术：
1、人参为五加科名贵中药材，但种植过程中人参的土壤理化性状会出现恶化现象，包括土壤中真菌群落物种丰富度降低、群落结构均一性降低、人参病原菌富集，导致人参土传病害增加等。若继续使用该参地栽种人参，土壤中富集的病原菌会利用人参生长过程中释放的须根生物质进一步大量增殖，导致严重的人参须根脱落、烧须、存苗率下降等问题，直接影响人参的产量和质量。研究表明，2年生的人参苗移植到老参地3个月以后，根腐病发生率为95.8％，侧根生长抑制率为37.3％；在老参地直播西洋参种子，到第3年有70％以上的西洋参表现出不同程度的根腐症状；新参地中根腐病的患病率只有20％。
2、目前改善参地土壤健康状况的方法主要有农业防治、化学防治和生物防治。传统的农业防治方法防治效果往往不稳定，长期使用化学农药防治会破坏土壤的微生态环境，加重农药对环境的污染；生物防治是以从人参染病的根部、茎部分离的病原菌为指示菌株，采用平板对峙培养法筛选具抑菌作用的微生物，上述筛选方法操作复杂，且只能针对部分病原菌有效。因此需要开发可高效便捷改善参地土壤健康状况的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种改善参地土壤健康状况的方法，具体包括如下步骤：通过清除参地土壤中的人参须根生物质，来抑制土壤中人参致病菌的生长和富集，改善参地土壤健康状况。
2、本发明优选的技术方案中，所述人参须根生物质为已经死亡的人参须根，或者移栽操作过程中从根系脱落的人参须根。
3、本发明优选的技术方案中，所述改善土壤健康状况包括调节真菌结构、抑制病原菌、消除土传病害的任一种或组合。
4、本发明优选的技术方案中，所述清除参地土壤中的人参须根生物质的方法为：将能够清除人参须根生物质的微生物加入到参地土壤中，通过能够清除人参须根生物质的微生物分解参地土壤中的人参须根生物质，实现人参须根生物质的及时有效清除，竞争性抑制人参病原菌的生长和富集。
5、本发明优选的技术方案中，所述参地土壤为种植人参的土壤。
6、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物即为人参须根生物质在土壤中富集的微生物，其筛选方法为；将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
7、本发明优选的技术方案中，所述基因测序方法为核糖体rna内转录间隔区(i tsrdna)测序、16s核糖体dna(16s rdna)测序的任一种。
8、本发明的另一目的在于提供一种预防参地土壤健康状况恶化的方法，具体包括如下步骤：通过清除参地残留的人参须根生物质，来预防参地土壤健康状况恶化。
9、本发明优选的技术方案中，所述人参须根生物质为已经死亡的人参须根，或者移栽操作过程中从根系脱落的人参须根。
10、本发明优选的技术方案中，所述预防土壤健康状况恶化包括调节真菌结构、抑制病原菌、消除土传病害的任一种或组合。
11、本发明优选的技术方案中，所述通过清除参地残留的人参须根生物质的方法为，将能够清除人参须根生物质的微生物加入到即将或正在种植人参的土壤中，通过能够清除人参须根生物质的微生物迅速分解人参种植过程中产生的人参须根生物质，竞争性抑制人参病原菌的生长和富集，实现人参须根生物质的及时有效清除。
12、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物即为人参须根生物质在土壤中富集的微生物，其筛选方法为：将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
13、本发明优选的技术方案中，所述基因测序方法为核糖体rna内转录间隔区(i tsrdna)测序、16s核糖体dna(16s rdna)测序的任一种。
14、本发明的另一目的在于提供能够清除人参须根生物质的微生物在预防参地土壤健康状况恶化或改善参地土壤健康状况中的应用。
15、本发明优选的技术方案中，所述人参须根生物质为已经死亡的人参须根，或者移栽操作过程中从根系脱落的人参须根。
16、本发明优选的技术方案中，所述预防土壤健康状况恶化或改善土壤健康状况包括调节真菌结构、抑制病原菌、消除土传病害的任一种或组合。
17、本发明优选的技术方案中，所述应用为，将能够清除人参须根生物质的微生物加入到已种植人参的土壤或即将种植人参的土壤中，通过能够清除人参须根生物质的微生物迅速分解人参种植过程中产生的人参须根生物质，竞争性抑制人参病原菌的生长和富集，实现人参须根生物质的及时有效清除。
18、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物为，将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
19、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科(chaetomiaceae)、丛赤壳科(nectriaceae)、肉座菌科(hypocreaceae)、小囊菌科(microascaceae)、葡萄穗黴科(stachybotryaceae)、曲霉科(aspergillaceae)、发菌科(trichocomaceae)、小疱毛壳科(herpotrichiellaceae)、锁掷孢酵母科(sporidiobolaceae)、毛孢子菌科(trichosporonaceae)和毛霉科(mucoraceae)的任一种或其组合。
20、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科毛壳属(chaetomium)、毛壳科腐质霉属(humicola)、曲霉科青霉属(penicillium)、曲霉科曲霉属(aspergillus)、毛霉科根霉属(rhizopus)的任一种或其组合。
21、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括鞘氨醇单胞菌属(sph ingomonas)、苯基杆菌属(pheny lobacter ium)、鞘氨醇杆菌属(sphingobium)、新鞘氨醇杆菌属(novosph ingobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、假黄色单胞菌属(pseudoxanthomonas)、链霉菌属(streptomyces)、黄杆菌属(f l avobacter ium)、噬几丁质菌属(ch it inophaga)、芽孢杆菌属(baci l l us),鞘脂杆菌属(pedobacter)中的任一种或其组合。
22、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括哈茨木霉(trichoderma harzianum)、少根根霉(rhizopus arrhizus)、米曲霉(aspergillusoryzae)中的任一种或其组合。
23、本发明优选的技术方案中，所述基因测序方法为核糖体rna内转录间隔区(i tsrdna)测序、16s核糖体dna(16s rdna)测序的任一种。
24、本发明的另一目的在于提供一种能够清除人参须根生物质的微生物的筛选方法，包括如下步骤：将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
25、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科(chaetomiaceae)、丛赤壳科(nectriaceae)、肉座菌科(hypocreaceae)、小囊菌科(microascaceae)、葡萄穗黴科(stachybotryaceae)、曲霉科(aspergillaceae)、发菌科(trichocomaceae)、小疱毛壳科(herpotrichiellaceae)、锁掷孢酵母科(sporidiobolaceae)、毛孢子菌科(trichosporonaceae)和毛霉科(mucoraceae)的任一种或其组合。
26、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科毛壳属(chaetomium)、毛壳科腐质霉属(humicola)、曲霉科青霉属(penicillium)、曲霉科曲霉属(aspergillus)、毛霉科根霉属(rhizopus)的任一种或其组合。
27、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括鞘氨醇单胞菌属(sph ingomonas)、苯基杆菌属(pheny lobacter ium)、鞘氨醇杆菌属(sphingobium)、新鞘氨醇杆菌属(novosph ingobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、假黄色单胞菌属(pseudoxanthomonas)、链霉菌属(streptomyces)、黄杆菌属(f l avobacter ium)、噬几丁质菌属(ch it inophaga)、芽孢杆菌属(baci l l us),鞘脂杆菌属(pedobacter)中的任一种或其组合。
28、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括哈茨木霉(trichoderma harzianum)、少根根霉(rhizopus arrhizus)、米曲霉(aspergillusoryzae)中的任一种或其组合。
29、本发明优选的技术方案中，所述基因测序方法为核糖体rna内转录间隔区(i tsrdna)测序、16s核糖体dna(16s rdna)测序的任一种。
30、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物的筛选方法还包括将能够清除人参须根生物质的微生物分离出来。
31、本发明优选的技术方案中，所述分离包括方法1或方法2的任一种：
32、方法1:将人参须根生物质与土壤混合后培养，加无菌水悬浮，得悬浮液，将土壤悬浮液连续稀释后涂布于平板培养基表面，及时分离生长的微生物，经过反复转接分离纯化得到的微生物，即为能够清除人参须根生物质的微生物；
33、方法2：将人参须根生物质直接插入土壤中，观察到人参须根生物质表面出现菌丝时，将人参须根生物质取出，经表面消毒后再接种到平板培养基上，及时分离生长的微生物，并经过反复转接分离纯化得到的微生物，即为能够清除人参须根生物质的微生物。
34、本发明优选的技术方案中，所述土壤含水量为土壤最大持水率的50％-60％。
35、本发明优选的技术方案中，所述土壤为河沙、玉米地土壤、大豆地土壤中的任一种。
36、本发明优选的技术方案中，所述人参须根生物质经粉碎成粗粉后，再加入到土壤中。
37、本发明优选的技术方案中，所述的平板培养基为能够清除人参须根生物质的微生物的特异性培养基。
38、本发明优选的技术方案中，所述方法1为，按照1：20-50的重量比在土壤中加入人参须根生物质，充分混匀后，室温培养20-40天，加入10-20倍体积的无菌水悬浮，得悬浮液；将悬浮液涂布在komada培养基表面，25-35℃下培养，每天观察菌落生长情况，并及时将生长的菌落转移到pda培养基上进一步培养，经多次转接分离纯化，获得能够清除人参须根生物质的微生物。
39、本发明优选的技术方案中，所述方法2为，按照人参须根生物质和土壤重量比为1：20-50，将人参须根生物质插入河沙中，25-30℃恒温避光培养，每日观察人参须根的变化，待人参须根表面及两端长出菌丝，可将须根取出，将长有菌丝的人参须根用50％的乙醇快速冲洗消毒30-60s，然后用无菌水冲洗30-60s，重复1-3次后，接种于komada培养基中25-30℃恒温避光培养，观察菌落生长状态，待有菌丝从komada培养基长出以后，用无菌针将人参须根周围生长在komada培养基上的菌丝挑出，转接于komada培养基中继续培养，得到能够清除人参须根生物质的微生物。
40、本发明优选的技术方案中，所述komada培养基的制备方法为：四硼酸钠1g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、edta铁钠盐0.01g、d-半乳糖20g、l-天门冬酰胺2g、琼脂15g、五氯硝基苯1g、牛胆盐0.5g，无需灭菌，用蒸馏水定容至1l，充分加热至上述所有成分完全溶解后，用10％的盐酸调ph至4.0，加入硫酸链霉素0.3g，即得。
41、本发明优选的技术方案中，所述马铃薯葡萄糖培养基(pda)的制备方法为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，用1l蒸馏水将切块后的马铃薯煮沸30分钟，纱布过滤后再用蒸馏水将滤液定容至1l，趁热加入葡萄糖和琼脂，混匀，121℃湿热灭菌20min，即得。
42、本发明的另一目的在于提供一种能够清除人参须根生物质的微生物的分离方法，包括如下步骤：
43、(1)将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物；
44、(2)将能够清除人参须根生物质的微生物分离出来。
45、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科(chaetomiaceae)、丛赤壳科(nectriaceae)、肉座菌科(hypocreaceae)、小囊菌科(microascaceae)、葡萄穗黴科(stachybotryaceae)、曲霉科(aspergillaceae)、发菌科(trichocomaceae)、小疱毛壳科(herpotrichiellaceae)、锁掷孢酵母科(sporidiobolaceae)、毛孢子菌科(trichosporonaceae)和毛霉科(mucoraceae)的任一种或其组合。
46、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括毛壳科毛壳属(chaetomium)、毛壳科腐质霉属(humicola)、曲霉科青霉属(penicillium)、曲霉科曲霉属(aspergillus)、毛霉科根霉属(rhizopus)的任一种或其组合。
47、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括鞘氨醇单胞菌属(sph ingomonas)、苯基杆菌属(pheny lobacter ium)、鞘氨醇杆菌属(sphingobium)、新鞘氨醇杆菌属(novosph ingobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、假黄色单胞菌属(pseudoxanthomonas)、链霉菌属(streptomyces)、黄杆菌属(f l avobacter ium)、噬几丁质菌属(ch it inophaga)、芽孢杆菌属(baci l l us),鞘脂杆菌属(pedobacter)中的任一种或其组合。
48、本发明优选的技术方案中，所述基因测序方法为核糖体rna内转录间隔区(i tsrdna)测序、16s核糖体dna(16s rdna)测序的任一种。
49、本发明优选的技术方案中，所述能够清除人参须根生物质的微生物包括哈茨木霉(trichoderma harzianum)、少根根霉(rhizopus arrhizus)、米曲霉(aspergillusoryzae)中的任一种或其组合。
50、本发明优选的技术方案中，所述分离包括方法1或方法2的任一种：
51、方法1:将人参须根生物质与土壤混合后培养，加无菌水悬浮，得悬浮液，将土壤悬浮液连续稀释后涂布于平板培养基表面，及时分离生长的微生物，经过反复转接分离纯化得到的微生物，即为能够清除人参须根生物质的微生物；
52、方法2：将人参须根生物质直接插入土壤中，观察到人参须根生物质表面出现菌丝时，将人参须根生物质取出，经表面消毒后再接种到平板培养基上，及时分离生长的微生物，并经过反复转接分离纯化得到的微生物，即为能够清除人参须根生物质的微生物。
53、本发明优选的技术方案中，所述土壤含水量为土壤最大持水率的50％-60％。
54、本发明优选的技术方案中，所述土壤为河沙、玉米地土壤、大豆地土壤中的任一种。
55、本发明优选的技术方案中，所述人参须根生物质经粉碎成粗粉。
56、本发明优选的技术方案中，所述的平板培养基为能够清除人参须根生物质的微生物的特异性培养基。
57、本发明优选的技术方案中，所述方法1为，按照1：20-50的重量比在土壤中加入人参须根生物质，充分混匀后，室温培养20-40天，加入10-20倍体积的无菌水悬浮，得悬浮液；将悬浮液涂布在komada培养基表面，25-35℃下培养，每天观察菌落生长情况，并及时将生长的菌落转移到pda培养基上进一步培养，经多次转接分离纯化，获得能够清除人参须根生物质的微生物。
58、本发明优选的技术方案中，所述方法2为，按照人参须根生物质和土壤重量比为1：20-50，将人参须根生物质插入河沙中，25-30℃恒温避光培养，每日观察人参须根的变化，待人参须根表面及两端长出菌丝，可将须根取出，将长有菌丝的人参须根用50％的乙醇快速冲洗消毒30-60s，然后用无菌水冲洗30-60s，重复1-3次后，接种于komada培养基中25-30℃恒温避光培养，观察菌落生长状态，待有菌丝从komada培养基长出以后，用无菌针将人参须根周围生长在komada培养基上的菌丝挑出，转接于komada培养基中继续培养，得到能够清除人参须根生物质的微生物。
59、本发明优选的技术方案中，所述komada培养基的制备方法为：四硼酸钠1g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、edta铁钠盐0.01g、d-半乳糖20g、l-天门冬酰胺2g、琼脂15g、五氯硝基苯1g、牛胆盐0.5g，无需灭菌，用蒸馏水定容至1l，充分加热至上述所有成分完全溶解后，用10％的盐酸调ph至4.0，加入硫酸链霉素0.3g，即得。
60、本发明优选的技术方案中，所述马铃薯葡萄糖培养基(pda)的制备方法为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，用1l蒸馏水将切块后的马铃薯煮沸30分钟，纱布过滤后再用蒸馏水将滤液定容至1l，趁热加入葡萄糖和琼脂，混匀，121℃湿热灭菌20min，即得。
61、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
62、1、本发明利用人参须根生物质在土壤中分解会选择性过滤土壤微生物群落结构、富集尖孢镰刀菌等人参病原菌以及与病原菌竞争人参须根生物质的微生物的特性，将能够有效清除人参须根生物质的微生物加入到人参须根生物质富集土壤中，可实现人参须根生物质的有效清除，为预防或改善土壤健康状况恶化提供了新的解决策略。
63、2、本发明将人参须根生物质加入土壤中，利用感染土壤微生物的人参须根生物质可以准确定位到能够清除人参须根生物质的微生物，筛选过程简单，筛选效率高，可工业化生产。
64、3、本发明筛选出来的能够有效清除人参须根生物质的微生物，加入到已种植人参的土壤或即将种植人参的土壤中，可用于调节真菌结构、抑制病原菌、消除土传病害，用于人参种植中，可提高人参保苗率、产量和质量。
1.一种改善参地土壤健康状况的方法，具体包括如下步骤：通过清除参地残留的人参须根生物质，来改善参地土壤健康状况。
2.如权利要求1所述的方法，所述人参须根生物质为已经死亡的人参须根，或者移栽操作过程中从根系脱落的人参须根。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，所述通过清除参地残留的人参须根生物质的方法为：将能够清除人参须根生物质的微生物加入到参地土壤中，通过能够清除人参须根生物质的微生物分解参地土壤中人参须根生物质，实现人参须根生物质的清除。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述能够清除人参须根生物质的微生物即为人参须根生物质在土壤中富集的微生物，其筛选方法为：将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
5.一种预防参地土壤健康状况恶化的方法，具体包括如下步骤：通过清除参地土壤中人参须根生物质，来预防参地土壤健康状况恶化。
6.如权利要求5所述的方法，所述通过清除参地土壤中人参须根生物质的方法为，将能够清除人参须根生物质的微生物加入到即将种植或正在种植人参的土壤中，通过能够清除人参须根生物质的微生物迅速分解人参种植过程中产生的人参须根生物质，实现人参须根生物质的清除。
7.如权利要求5-6任一项所述的方法，所述能够清除人参须根生物质的微生物即为人参须根生物质在土壤中富集的微生物，其筛选方法为：将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
8.能够清除人参须根生物质的微生物在预防参地土壤健康状况恶化或改善参地土壤健康状况中的应用。
9.一种能够清除人参须根生物质的微生物的筛选方法，包括如下步骤：将人参须根生物质添加到土壤中培养，采用基因测序的方法测定土壤中微生物的丰度变化，与原土壤中的微生物比较，丰度显著升高的微生物即为能够清除人参须根生物质的微生物。
10.一种能够清除人参须根生物质的微生物的分离方法，包括如下步骤：
