本发明涉及生物芯片及微生物检测方法，具体涉及一种检测常见真核藻的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法。
背景技术：
1、真核藻类为一群没有根、茎、叶分化，能进行光合作用的低等自养真核植物，大约出现于15亿～14亿年前。形态包括单细胞、各式群体、丝状体、叶状体、管状体等。大小从几微米到几米（海带），甚至百米（巨藻）结构简单，无明显组织分化。真核藻类可分为绿藻门（chlorophyta）、轮藻门（charophyta）、裸藻门（euglenophyta）、硅藻门（bacillariophyta）等。其中，绿藻门和硅藻门是两大重要的藻类群，它们在全球水体中广泛分布，对环境变化和人类活动的响应敏感。
2、绿藻门包括一大类多样的单细胞和多细胞真核藻类，其细胞内含有叶绿素和类固醇，使其能够光合作用。这些藻类通过各种生活方式，如浮游生活、附着生活和自由漂浮，广泛分布于不同水体环境中，包括湖泊、河流、水库和海洋。由于其对光和营养物质的需求不同，绿藻门在水体的生态系统功能中扮演着重要角色，影响着水中氧气生成、碳循环和底栖生物的食物供应链。此外，绿藻门的物种多样性和分布格局对水体健康和生物多样性的维持具有重要意义。例如，某些绿藻类能够形成大规模的水华，不仅对生态系统造成影响，还可能对水资源的可利用性和人类健康构成威胁。
3、硅藻门包括硅藻亚门和黄金藻亚门等多种类型，其细胞内含有硅质壳，在水体中广泛分布，生活方式包括浮游、底栖和附生等多种形式。由于其富含硅的细胞壳具有高度的适应性和多样性，硅藻类能够在不同水体环境中广泛生存和繁殖。在生态系统功能中，硅藻类通过光合作用和硅素循环对水体的生态平衡和生物多样性维护起着重要作用。其生物量和群落结构对水体透明度、氧气生成和底栖生物的食物链有显著影响。此外，硅藻类生物的生长与环境因子如温度、光照和营养物质密切相关，对水体质量的监测和管理提出了挑战。
4、目前已知，部分真核藻具有生物环境价值：如小球藻能够通过光合作用吸收水中的二氧化碳和氮、磷等营养盐，释放出氧气，从而降低水中的有机物和无机物浓度，减少污染物的积累，提高溶解氧含量，维持水体的酸碱平衡。这样，就能够为水产动物创造一个清洁、舒适、健康的生存环境。但也存在部分藻类水华频繁爆发，引起环境污染。引起爆发的藻种的实时监测和快速鉴定，仍然是个突出的问题。藻种的准确鉴定，对于评估藻华的危害和制定预防和治理的措施非常重要。
5、真核藻类现有藻类物种的鉴定和分类方法主要以传统的形态学检测为主，但根据简单的外部形态和内部生理结构上的细微差异性以及高度的表型可塑性，部分藻类难以区分和鉴定，这使得藻类分类学的发展面临巨大挑战。传统的检测真核藻生物方法主要包括显微镜观察、生物量测定和色素分析等。尽管传统方法在真核藻生物分类和鉴定方面积累了大量的经验和数据，但也存在明显的局限性。例如，借助显微镜观察的方法不仅存在耗时长、需要专业知识和操作经验，而且环境样品中的真核藻生物种类繁多，部分物种比例极低，准确性易受主观因素的影响，而生物量测定和色素分析等方法也只能给出较笼统或间接的评估结果。
6、随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（pcr）和高通量测序（ngs）的技术，也常被应用于真核藻生物的检测和鉴定。如16s rrna测序技术，该技术利用特定引物靶向扩增真核藻生物各个物种基因组中16s rrna的保守区域，能够在属水平对环境样品进行定量，但无法鉴定到种水平。其他如荧光原位杂交（fish）和酶联免疫吸附测定（elisa）等技术方法亦无法将环境样本中的各种真核藻生物快速准确地鉴定到种水平。
7、基因芯片技术是一种高通量、高灵敏度的核酸检测技术，其基本原理是在一个微小的固体表面上固定大量的特异性核酸探针，通过与样品中的目标核酸序列杂交，检测和分析样品中的基因信息。基因芯片技术能够在一次实验中同时检测数百到数千个基因，在水体真核藻生物检测中展现出巨大的应用潜力。将基因芯片技术应用于水体真核藻检测领域，或许将为我们提供一种新颖而高效的方法，以更全面、迅速地了解水体中真核藻的分布和种群动态，这一应用有望进一步推动水生态系统监测技术的发展，为水质评价、富营养化预警和生态环境保护提供有力支持。
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的一种，本发明提供了一种检测常见真核藻的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法。
2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：
3、本发明的第一方面提供了一种检测常见真核藻的探针组合，所述探针组合包括检测 chlorella vulgaris的探针组，探针组中的11条探针序列如seq id no.1至seq idno.11所示，检测scenedesmus sp. nrel 46b-d3的探针组，探针组中的8条探针序列如seqid no.12至seq id no.19所示，检测amphora coffeaeformis的探针组，探针组中的9条探针序列如seq id no.20至seq id no.28所示，检测ankistrodesmus sp. ccac 3332 b的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.29至seq id no.38所示，检测coelastrummicroporum的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.39至seq id no.48所示，检测pediastrum duplex的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.49至seq idno.58所示，检测tetraedron minutum的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.59至seq id no.68所示，检测nitzschia inconspicua的探针组，探针组中的9条探针序列如seq id no.69至seq id no.77所示，检测synedra sp. rcc2510的探针组，探针组中的9条探针序列如seq id no.78至seq id no.86所示，检测cyclotella atomus的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.87至seq id no.96所示，检测achnanthes kuwaitensis的探针组，探针组中的10条探针序列如seq id no.97至seq id no.106所示，检测naviculasp. rcc3092的探针组，探针组中的9条探针序列如seq id no.107至seq id no.115所示。
4、在一些实施方案中，所述常见真核藻的检测目标包括 chlorella vulgaris、 scenedesmus sp.nrel 46b-d3 、amphora coffeaeformis、ankistrodesmus sp.ccac3332b 、coelastrum microporum、pediastrum duplex、tetraedron minutum、nitzschia inconspicua、synedra sp.rcc2510 、cyclotella atomus、achnanthes kuwaitensis、 navicula sp.rcc3092等12个检测目标的探针，每个检测目标的探针包含8-10条特异检测探针组成的探针组。
5、在本发明的一些具体实施方案中，探针组合是由多种探针组组成的混合物；在一些具体实施方案中，探针组合包括1个、2个、3个......12个检测目标的检测对应的探针组；优选的具体实施方案中，探针组合包括全部12个检测目标的探针，并且包含对应检测常见真核藻的检测探针中的全部115条探针，可对上述各真核藻同时进行检测。所述探针仅与目标真核藻dna序列结合而不与任何其他真核藻dna序列结合的特异探针；探针设计步骤包括特异性探针初步筛选、对寡核苷酸片段进行敏感度筛选和理化性质一致性筛选。
6、本发明还提供了第一方面所述的探针组合在制备用于检测常见真核藻的基因芯片或者试剂盒中的应用，所述常见真核藻的检测目标包括 chlorella vulgaris、 scenedesmus sp.nrel 46b-d3 、amphora coffeaeformis、ankistrodesmus sp.ccac3332b 、coelastrum microporum、pediastrum duplex、tetraedron minutum、nitzschia inconspicua、synedra sp.rcc2510 、cyclotella atomus、achnanthes kuwaitensis、 navicula sp.rcc3092等12个检测目标，检测目标可以包含其中的一种，多种或者全部。
7、本发明的第二方面提供了一种检测常见真核藻的基因芯片，包括前文所述的探针组合。
8、本发明的第三方面提供了一种检测常见真核藻的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的探针组合或者第一方面所述的基因芯片。
9、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括待测样本dna提取试剂、dna纯化试剂以及dna荧光标记试剂。
10、本发明的第四方面提供了一种检测常见真核藻的方法，包括如下步骤：
11、（1）待测水样过滤，采集过滤得到的颗粒物并完成dna提取；
12、（2）提取的dna打断后进行纯化，得到gdna；
13、（3）对完成步骤（2）的gdna使用随机引物和带荧光基团的atcg碱基进行pcr，得到带荧光基团的gdna序列；
14、（4）在杂交炉中将（3）中得到的荧光标记gdna与前文所述的基因芯片进行杂交实验；
15、（5）对（4）杂交实验结果进行读取，根据读取的探针信号对常见真核藻检测结果进行判定；
16、其中，所述常见真核藻的检测目标包括 chlorella vulgaris、scenedesmus sp.nrel 46b-d3 、amphora coffeaeformis、ankistrodesmus sp.ccac 3332b 、coelastrum microporum、pediastrum duplex、tetraedron minutum、nitzschia inconspicua、synedra sp.rcc2510 、cyclotella atomus、achnanthes kuwaitensis、navicula sp.rcc3092。
17、在本发明的一些具体实施方案中，步骤（1）中的dna提取，（2）中的打断及纯化，（3）中的荧光标记以及（4）中的杂交，可使用本领域常规方法或者试剂盒进行。
18、在本发明的一些具体实施方案中，步骤（5）中对杂交实验结果的读取使用激光扫描仪对芯片进行扫描，荧光标记的探针区域会发出特定波长的光，这些信号会被扫描仪捕捉，最后扫描得到的图像数据将被转化为数字信号。
19、进一步地，对数据信号进行筛选，真核藻物种检出判定：对微阵列数据进行预处理，以消除样本间的系统差异并过滤掉假阳性检测。首先，通过从探针的前景强度中减去背景强度来校正原始信号强度，以进行背景校正。接下来，使用背景校正数据作为输入矩阵，将探针信号强度进行归一化，其目的是调整不同样本间的整体信号强度，确保它们之间具有可比性。归一化后，对未检测到的探针进行确定和删除。为了减少假阳性，还需要计算每个物种的探针检测率。探针检测率定义为一个物种检测到的探针数目除以该物种的所有设计探针数。如果一个物种的探针检测率大于设定的比例阈值，则将其归类为阳性，以确保只有真正的阳性结果被考虑，并减少假阳性率。
20、在本发明中，所述待测样本可以来源为任意水源，包括但不限于江、河、溪、海、湖泊、水库、池塘等任意流动的或不流动的水源。
21、本发明的有益效果
22、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
23、1、现有的真核藻分子检测技术大都将检测目标区域限定在16s rrna核糖体基因，因为目标检测区域较小因此分辨率较低，无法鉴定到种以及以下水平。本发明通过基因芯片技术，利用全基因组范围内物种特异探针，可以对物种水平的真核藻进行检测，弥补了现有检测技术分辨率不够的缺陷。
24、2、本发明利用基因芯片技术，可以同时对12种常见真核藻在水体中的存在进行检测。且该检测方法操作方法简单，相比较于基于测序的检测方法省去了目标区域pcr和测序的步骤，同时数据处理更为简单便捷。这种高通量，高分辨率的便捷真核藻物种检测方法对于水体水质恶化的长期动态监测具有重要应用价值，可指导藻华控制和水生态修复。
1.一种检测常见真核藻的探针组合，其特征在于：所述探针组合包括检测chlorella vulgaris的探针组，序列如seq id no.1至seq id no.11所示，检测scenedesmus sp. nrel46b-d3的探针组，序列如seq id no.12至seq id no.19所示，检测amphora coffeaeformis的探针组，序列如seq id no.20至seq id no.28所示，检测ankistrodesmus sp. ccac3332 b的探针组，序列如seq id no.29至seq id no.38所示，检测coelastrum microporum的探针组，序列如seq id no.39至seq id no.48所示，检测pediastrum duplex的探针组，序列如seq id no.49至seq id no.58所示，检测tetraedron minutum的探针组，序列如seqid no.59至seq id no.68所示，检测nitzschia inconspicua的探针组，序列如seq idno.69至seq id no.77所示，检测synedra sp. rcc2510的探针组，序列如seq id no.78至seq id no.86所示，检测cyclotella atomus的探针组，序列如seq id no.87至seq idno.96所示，检测achnanthes kuwaitensis的探针组，序列如seq id no.97至seq idno.106所示，检测navicula sp. rcc3092的探针组，序列如seq id no.107至seq idno.115所示。
2.权利要求1所述的探针组合在制备用于检测常见真核藻的基因芯片或者试剂盒中的应用，其特征在于：所述常见真核藻的检测目标包括chlorella vulgaris、scenedesmussp. nrel 46b-d3、amphora coffeaeformis、ankistrodesmus sp. ccac 3332 b、coelastrum microporum、pediastrum duplex、tetraedron minutum、nitzschia inconspicua、synedra sp. rcc2510、cyclotella atomus、achnanthes kuwaitensis、navicula sp. rcc3092。
3.一种检测常见真核藻的基因芯片，其特征在于：包括权利要求1所述的探针组合。
4.一种检测常见真核藻的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的探针组合或者权利要求3所述的基因芯片。
5.根据权利要求4所述的一种检测常见真核藻的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括待测样本dna提取试剂、dna纯化试剂以及dna荧光标记试剂。
6.一种检测常见真核藻的方法，其特征在于，包括如下步骤：
