本发明属于生物，尤其涉及一种用于鉴定银鼓鱼遗传性别的特异性分子标记及其应用。
背景技术：
1、在雌雄异体的脊椎动物中，多数在形态和生理上具有明显的性别二态性(herpinand sc hartl,2015)。鱼类作为脊椎动物中数量最丰富的类群，许多鱼类在生长速率、体型大小和体色等也存在显著的性别差异(kobayashi et al.,2013；mei and gui,2015)。为了增加产量和提高养殖效益，对于存在性别二态性的养殖鱼类采用单性繁殖方式，可以实现最佳的经济效益。如雌性牙鲆(paralichthys olivaceus)的体重是同龄雄性个体的1.8～2.9倍，全雌化养殖是提高其养殖产量的关键技术之一(yoneda et al.,2007)；相反，1龄雄性黄颡鱼(pelteobagrus fulvidraco)比同龄雌鱼的生长速度快30％左右，全雄化养殖可以增加产量和提高效益(wan g et al.,2009)。因此，根据鱼类雌雄经济性状的性别差异，开展性别控制对水产养殖具有重要意义。
2、鱼类性别具有可塑性，以xy性别决定系统鱼类为例，可诱导xx个体逆转为伪雄鱼，将xx伪雄鱼与正常xx雌鱼交配获得全雌后代；另一方面，诱导xy个体逆转为伪雌鱼，将xy伪雌鱼与xy正常雄鱼交配，获得yy超雄鱼，yy超雄鱼与正常xx雌鱼交配获得全雄后代(meiand gui,2015)。遗传性别快速鉴定是鱼类性别控制育种关键技术之一，性别特异分子标记的开发应用，为实现性控育种提供必要的工具。迄今为止，研究者基于基因组测序技术在多种经济鱼类成功开发出性别特异分子标记，这些分子标记的开发大部分建立在鱼类性染色体相关研究的基础上(zheng et al.,2022；sun et al.,2022；ye et al.,2023)。如郑树清等基于xx、xy、yy三种基因型胡子鲇基因组测序数据，对其x与y染色体进行序列比对分析，开发了4对性别特异的分子标记(zheng et al.,2022)；孙莎等对黄姑鱼x和y染色体上dmrt1基因序列比较，也成功开发了2对可鉴定黄姑鱼遗传性别的分子标记(sun etal.,2022)。性别特异分子标记的开发为性控育种技术的发展提供了重要的方法指导和技术途径，同时也为破译鱼类性染色体奠定了基础。
3、对于性别决定系统为异配型的鱼类基因组，其基因组存在复杂的等位基因变异，在基因组组装过程很难将这些变异拆分，最终组装获得的伪单倍体基因组存在许多嵌合体序列，进而影响基因组的后续注释和分析工作(korlach et al.,2017)。最近几年，以全基因组为基础的高通量测序和组装技术得到了迅速发展，逐渐开发出了一些单倍体基因组组装技术，并成功应用于不同物种的单倍体基因组组装。在单倍体基因组组装中，核心环节是对测序数据进行单倍体分型，不同的分型策略将影响到单倍体组装效率和准确性。家系分型策略和物理分型策略是目前单倍体基因组分型的主要方法。家系分型策略需要提供双亲本及f1代的全部遗传背景信息，并结合高通量测序数据才能进行有效准确分型。如何突破传统的家系及遗传信息对单倍型的依赖性成为研究的新方向。garg和porubsky利用hifi三代测序hi-c辅助组装技术，分别开发了dipasm(garg et al.,2021)和链特异性测序结合长读长测序的单倍体基因组分型方法(porubsky et al.,2021)，基于hifi的精确性和hi-c的可靠性，分别完成了人类基因组单倍体高精度拆分和组装，打破了家系和遗传信息的局限，建立了单倍体基因组组装的新思路。
4、多纹钱蝶鱼(selenotoca multifasciata)隶属于鲈形目(perciformes)，金钱鱼科(scatophag idae)，钱蝶鱼属，是我国东南沿海名优养殖鱼类，又称银鼓鱼，具有xy雄性异配性别决定系统。银鼓鱼生长具有明显的两性差异，同龄雌鱼的生长明显快于雄鱼，全雌苗种的培育可以提高养殖效益。此外，银鼓鱼体色以银白色为主，体表两侧腹部有稀疏的数十个黑色圆斑，似金钱状；体表两侧背部有数条黑色横带，亦可作为水族箱的观赏鱼之一。根据银鼓鱼的观赏价值，市场更倾向于体型较小的雄鱼，故生产全雄银鼓鱼也具有一定的经济效益。开发一种准确快速鉴定银鼓鱼遗传性别的分子标记是其单性苗种生产的重要基础。前期基于银鼓鱼的二代基因组测序数据分析，在其性别决定候选基因dmrt1上开发了三对性别连锁的分子标记(jiang et al.,2022)。然而，由于使用的是二代基因组数据，组装的基因组为连续性较差的contigs序列，且contig n50为1959bp，无法获取完整的性染色体序列。本课题组利用hifi测序技术和hi-c辅助组装技术，成功组装出xy雄性银鼓鱼两套染色体水平的单倍型基因组。此外，对银鼓鱼重测序数据分析，确定了其性染色体和性别决定区间，这些研究为本研究奠定了重要的基础。将前期开发的性别连锁分子标记与单倍型基因组进行比对，发现前期(专利cn113718043b)开发的性别连锁分子仅雄性连锁的标记定位于y染色体，且y染色体特异，而雌性连锁的分子标记定位于4号常染色体，未与x染色体连锁。因此前期开发的分子标记仅部分与性染色体连锁，不能用于xx个体遗传基因型的鉴定，需要针对银鼓鱼性染色体重新开发性染色体特异的分子标记。
技术实现思路
1、本发明对银鼓鱼x和y染色体进行比较分析，在x和y染色体存在显著差异的序列上成功开发了一对可准确快速鉴定银鼓鱼遗传性别的分子标记。此次开发的分子标记与银鼓鱼性染色体连锁，可准确鉴定其基因型，对实现银鼓鱼性别控制(图1)和性别决定和分化机制研究具有重要意义。
2、本发明提供了一种用于鉴定银鼓鱼遗传性别的indel分子标记，所述indel分子标记的多态性为缺失/插入序列，可通过序列如seq id no.3、4所示特异性引物扩增得到。
3、本发明还提供了一种用于检测上述indel分子标记的特异性引物，所述特异性引物的序列如seq id no.3、4所示。
4、本发明还提供了上述特异性引物在鉴定银鼓鱼遗传性别中的应用。
5、本发明还提供了上述indel分子标记在鉴定银鼓鱼遗传性别中的应用。
6、本发明还提供了含有上述特异性引物的产品。
7、优选地，所述产品为试剂盒。
8、更优选地，所述试剂盒中还含有阳性对照质粒，所述阳性对照质粒包括两种，一种含有序列如seq id no.1所示的核苷酸序列，另一种含序列如seq id no.2所示的核苷酸序列。
9、本发明还提供了一种鉴定银鼓鱼遗传性别的方法，所述方法包括如下步骤：
10、s1.提取待测样本基因组dna；
11、s2.以权利要求2所述引物对步骤s1提取的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；
12、s3.通过扩增结果判断银鼓鱼的遗传性别，判断标准为：
13、如果pcr扩增产物只有一条307bp片段，则待测样本为xx雌鱼；
14、如果pcr扩增产物有两条片段，一条为307bp，另一条为390bp，则待测样本为xy雄鱼。
15、优选地，所述pcr扩增的体系为2×pcr mix 10μl，10μmol/l正反向引物各0.4μl，基因组dna 1μl，ddh2o 8.2μl，共20μl。
16、更优选地，所述pcr扩增的程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，37个循环；72℃10min延伸，4℃保存。
17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18、本发明从银鼓鱼基因组信息中筛选到两条在x和y染色体上部分同源dna片段，并设计特异性引物进行银鼓鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确的区分银鼓鱼遗传性别。本发明的方法在xx雌性和xy雄性中都可扩增出特异dna片段，并可用琼脂糖凝胶电泳法区分，适用于实验室或养殖企业准确鉴定银鼓鱼遗传性别。本发明检测银鼓鱼遗传性别的方法可用于对不同生长阶段和不同群体的银鼓鱼性别鉴定和筛选，对研究银鼓鱼性别控制育种以及养殖具有重要意义。
1.一种用于鉴定银鼓鱼遗传性别的indel分子标记，其特征在于，所述indel分子标记的多态性为缺失/插入序列，通过序列如seq id no.3、4所示特异性引物扩增得到。
2.一种用于检测权利要求1所述的indel分子标记的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列如seq id no.3、4所示。
3.权利要求2所述的特异性引物在鉴定银鼓鱼遗传性别中的应用。
4.权利要求1所述的indel分子标记在鉴定银鼓鱼遗传性别中的应用。
5.含有权利要求2所述的特异性引物的产品。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性对照质粒，所述阳性对照质粒包括两种，一种含有序列如seq id no.1所示的核苷酸序列，另一种含序列如seq id no.2所示的核苷酸序列。
8.一种鉴定银鼓鱼遗传性别的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的体系为2×pcr mix 10μl，10μmol/l正反向引物各0.4μl，基因组dna 1μl，ddh2o 8.2μl，共20μl。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，37个循环；72℃10min延伸，4℃保存。
