本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种工程化干细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
1、局灶性硬皮病(localized scleroderma)是一种慢性、自身免疫性疾病，主要特征为皮肤和结缔组织的过度纤维化，导致皮肤硬化和功能障碍。现有治疗方法包括免疫抑制剂、抗炎药物和物理治疗等，但这些方法疗效有限且副作用较多。脂肪间充质干细胞(adscs)及其分泌的肝细胞生长因子(hgf)为局灶性硬皮病提供了一种新的治疗手段。
2、脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,adscs)是一种来源丰富、易于获取的多能干细胞，具有显著的免疫调节和组织修复能力。近年来，adscs在治疗多种纤维化疾病中展现了巨大的潜力。adscs不仅可以分化为多种细胞类型，还能分泌多种具有生物活性的因子，如肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子(vegf)等，这些因子在组织修复和抗纤维化方面发挥重要作用。有研究表明，adscs通过分泌抗纤维化因子和免疫调节因子，可以减轻肺纤维化和肝纤维化的程度。在一项研究中，adscs被移植到硅尘诱导的肺纤维化小鼠模型中，结果显示adscs显著减少了肺纤维化，并通过抑制巨噬细胞活化和促进肌成纤维细胞凋亡，发挥了其抗纤维化作用。
3、肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor,hgf)是一种由间充质细胞分泌的多功能因子，具有促细胞生长、抗纤维化和抗炎等多种生物学功能。hgf通过其受体c-met激活多种信号通路，调节细胞增殖、运动、分化和存活。研究表明，hgf在多种纤维化疾病中具有显著的治疗效果，如肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化。在一项关于慢性肾病的研究中，通过注射重组hgf，观察其对肾纤维化和功能障碍的影响。结果表明，hgf显著抑制了肾纤维化进程，并改善了肾功能，显示出其在抗纤维化治疗中的巨大潜力
4、有研究表明，adscs被移植到肺纤维化小鼠体内，通过组织学分析和生物化学检测，评估其对肺纤维化的影响。研究发现，adscs通过分泌抗炎因子和促凋亡因子，显著减轻了肺纤维化程度，并改善了小鼠的肺功能(gao j,yuan j,等.adipose-derived stemcells therapy effectively attenuates pm2.5-induced lung injury.stem cell resther.)。尽管adscs在动物模型中显示出治疗效果，但其具体机制尚不完全清楚。文章没有明确对于疾病治疗的有效作用因子，尤其是对于纤维化治疗的效应因子。因此难以实现通过工程化adscs，增强其抗纤维化能力的目的。
5、有研究表明，重组hgf被注射到慢性肾病小鼠模型中，通过组织学分析、基因表达检测和功能评估，研究其对肾纤维化和功能障碍的影响。结果显示，hgf通过抑制成纤维细胞活化和胶原沉积，显著减轻了肾纤维化，并改善了肾功能(mizuno s,kurosawa t等.hepatocyte growth factor prevents renal fibrosis and dysfunction in a mousemodel ofchronic renal disease.)。尽管hgf显示出良好的抗纤维化效果，但其短半衰期和体内稳定性差，限制了其临床应用。此外，高成本的生产和纯化工艺也是一个挑战。长期和大剂量使用hgf的安全性仍需进一步验证。
6、综上所述，局灶性硬皮病尚无有效治疗方法，且现有背景技术在纤维化疾病治疗中显示出一定的潜力，但也存在诸多不足。通过高表达hgf的工程化adscs进行治疗，有望克服现有方法的不足，提供一种新型、高效的硬皮病治疗方法。
技术实现思路
1、本发明旨在克服现有硬皮病治疗方法的不足，提供一种基于高表达肝细胞生长因子(hgf)的工程化脂肪间充质干细胞进行治疗的新方法。现有的治疗方法如免疫抑制剂、抗炎药物和物理治疗，尽管在一定程度上能够缓解症状，但疗效有限且副作用较多。脂肪间充质干细胞(adscs)因其显著的免疫调节和组织修复能力，成为一种潜在的治疗手段。然而，单纯使用adscs的治疗效果仍不理想。因此，通过基因工程手段，使adscs高表达hgf，增强其抗纤维化和促进组织修复的能力，从而更有效地治疗硬皮病。
2、本发明一方面提供了一种产生工程化干细胞的方法，所述方法包括：
3、(1)提供间充质干细胞或其衍生物；
4、(2)使所述间充质干细胞或其衍生物产生表现出抗纤维化功能上调和/或促进血管生成能力上调的工程化干细胞的条件。
5、优选地，使所述间充质干细胞或其衍生物产生表现出抗纤维化功能上调和/或促进血管生成能力上调的手段包括外源导入抗纤维化因子，如肝细胞生长因子(hgf)，基质金属蛋白酶(mmps)等。
6、在一优选实施例中，所述抗纤维化因子包含如seq id no:1中所示的核苷酸序列，或者具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性，并且保留了hgf活性的因子。
7、所述工程化的条件包括物理、化学或生物学方法，或其组合。例如，所述生物学方法包括使用病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。例如，所述化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠等；基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体等。例如，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。
8、在一优选实施例中，所述工程化的条件包括转染，如瞬转或稳转，电穿孔，病毒感染，显微注射等。
9、优选地，所用转染试剂：lipofectamine 3000，质粒为gv657。
10、本发明另一方面提供了一种工程化干细胞，其包含如seq id no:1中所示的核苷酸序列。
11、所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞来源骨髓、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等，优选来源于脂肪组织。
12、在另一个方面，本发明提供了一种培养物，其包含本发明的工程化的干细胞，以及培养基。
13、在本发明中，可用于干细胞培养的培养基是本领域技术人员已知的，其非限制性实施例包括，α-mem培养基、dmem培养基、imdm培养基、ham's f12培养基、rpmi1640培养基，以及上述任一项组合形成的混合培养基。在某些示例性实施方案中，所述培养基为不含有血清的友康培养基。
14、本发明的培养物可以作为生物制剂、药物组合物被配制和施用。这样的药物组合物可以是医学领域已知的任何形式，优选为注射剂。
15、在另一个方面，本发明提供了一种培养上清，其为本发明的培养物的上清液。
16、在某些优选的实施方案中，所述培养上清不含所述工程化干细胞。
17、在某些优选的实施方案中，所述培养上清包含基础培养基。在某些示例性实施方案中，所述培养上清不含有血清的友康培养基。
18、本发明的培养上清可以作为生物制剂、药物组合物被配制和施用。
19、本发明另一方面提供了一种生物制剂，其包含上述工程化干细胞，所述生物制剂为注射剂；优选地，所述生物制剂还包含药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述生物制剂还包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。
20、优选地，所述工程化干细胞的有效量是在100,000(1×105)至1,000,000(1×106)个细胞范围内。
21、本发明还一方面提供了上述生物制剂和所述工程化干细胞在制备治疗硬皮病生物制剂中的应用。
22、优选地，所述硬皮病包括局灶性硬皮病和系统硬化症。
23、优选地，所述工程化干细胞通过协同hgf和mmp1达到治疗硬皮病的目的。
24、优选地，所述工程化干细胞通过降低皮肤成纤维细胞(hdfs)的纤维化标志物包括collagen1、collagen3、α-sma和tgf-β1的表达水平来达到治疗硬皮病的目的。
25、在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
26、本发明的技术方案具有如下的有益效果：
27、本发明通过基因工程手段，使adscs高表达hgf，从而显著增强其抗纤维化和促进血管生成的能力，提供了一种新的治疗硬皮病的途径。具体以下效果和优点如下：
28、(1)提高治疗效果
29、抗纤维化能力增强：工程化adscs在体外实验中显著降低了皮肤成纤维细胞(hdfs)的纤维化标志物(如collagen1、collagen3、α-sma、tgf-β1)的表达水平。qpcr和westernblot结果显示，工程化adscs处理组的hdfs纤维化标志物表达量比普通adscs组和对照组分别降低了约50％和90％以上。
30、促进血管生成：工程化adscs分泌的hgf显著促进了内皮细胞的增殖和新生血管的形成。体外血管生成实验表明，工程化adscs组的管状结构形成数目是普通adscs组的2倍以上。
31、(2)提高安全性和稳定性
32、减少副作用：相比传统治疗方法(如免疫抑制剂和抗炎药物)，工程化adscs治疗方法具有更高的安全性，副作用明显减少。动物实验中，工程化adscs治疗组的小鼠未出现明显的免疫反应和炎症反应。
33、提高稳定性：通过基因工程手段使adscs高表达hgf，解决了hgf短半衰期和体内稳定性差的问题。工程化adscs在体内持续分泌hgf，确保了治疗效果的稳定和持久。
34、(3)提高效率和降低成本
35、提高治疗效率：工程化adscs的抗纤维化效果显著优于普通adscs和重组hgf蛋白。相同治疗条件下，工程化adscs组的小鼠皮肤纤维化缓解率90％以上，而普通adscs组和重组hgf蛋白组仅减少了约45％和25％。另外工程化adscs显著提升局灶性硬皮病小鼠的皮下脂肪厚度，约90％。
36、降低生产成本：相较于直接使用重组hgf蛋白，利用工程化adscs作为治疗手段，能够显著降低治疗成本，避免了高成本的hgf生产和纯化工艺。
37、(4)提供多效协同的治疗手段
38、多效协同作用：工程化adscs分泌的多种生物活性因子(如hgf、vegf等)具有协同作用，不仅能够抗纤维化，还能促进组织修复和血管生成。同时动物实验显示注射工程化adscs后，皮肤组织mmp1表达水平显著升高，这有助于纤维化组织内细胞外基质的讲解，从而改善纤维化，与hgf起到协同抗纤维化做用。体内抗纤维化和体外抗纤维化实验显示，工程化adscs的治疗效果远高于hgf重组蛋白治疗组，说明adscs分泌的其他细胞因子在治疗过程中提供一种多效协同的治疗手段。
39、改善患者生活质量：通过有效治疗局灶性硬皮病，工程化adscs显著改善了患者的皮肤功能和生活质量，减少了病痛和不适。
1.一种产生工程化干细胞的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗纤维化因子包含如seq id no:1中所示的核苷酸序列，或者具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性，并且保留了hgf活性的因子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程化条件包括转染。
4.一种工程化干细胞，其特征在于，其包含外源导入的如seq id no:1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的工程化干细胞，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞来源骨髓、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织。
6.一种生物制剂，其特征在于，其包含权利要求4或5所述工程化干细胞，所述生物制剂为注射剂；优选地，所述生物制剂还包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液。
7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述工程化干细胞的有效量是在1×105至1×106个细胞范围内。
8.权利要求4或5所述工程化干细胞，权利要求6或7所述生物制剂在制备治疗硬皮病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工程化干细胞通过协同hgf和mmp1达到治疗硬皮病的目的。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述工程化干细胞通过降低皮肤成纤维细胞的纤维化标志物包括collagen1、collagen3、α-sma和tgf-β1的表达水平来达到治疗硬皮病的目的。
