本发明涉及湿地松分子标记及遗传育种。具体涉及一种与湿地松松脂产量相关的dna片段、其紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术：
1、湿地松(pinus elliottii engelm.var.elliottii)原产于美国东南部，在我国引种栽培已经100多年，是我国南方重要的速生用材树种和绿色化工原料松脂生产树种，也是优良的松材线虫病抗性树种。松脂是松树次生木质部和韧皮部导管中分泌的自身防御物质，也是人类大规模使用的最重要的天然产物之一，可用于生产重要的工业化学品松香和松节油。我国现有湿地松面积已达2200多万亩，松脂年产量约60万吨，占全球60％的油树脂总量和50％的油树脂贸易量，仅初级原料松脂产值达20亿元以上。但目前松脂生产主要依靠大面积采出，树脂单产率较低，仅有不到10％的企业建立了经遗传改良的湿地松高产脂人工林，而且多数人工林盈利能力低下，严重影响了我国松脂产业的持续健康发展。
2、选育高产(松脂)质优的湿地松优良树种是世界松脂产业健康发展的基础和保障。一直以来，以选择和杂交育种为主要手段的湿地松育种工作取得了长足的进展，然而湿地松巨大且保守的基因组和漫长的生命周期严重阻碍了其常规育种的效率，优良家系和单株选育缓慢，远远不能满足松脂产业发展的需求，这已成为限制松脂产业发展的重要因素之一。
3、相比于传统育种技术，分子标记辅助育种可从苗期进行早期选择，大幅度缩短育种周期，对以木材和松脂为主要目的松树育种优势尤为明显。分子标记辅助育种依赖于有效的分子标记，因此，开发与湿地松松脂产量相关的分子标记，特别是鉴定控制湿地松松脂合成途径的分子标记和候选基因，并根据这些分子标记和候选基因的鉴定结果，设法提高湿地松单株松脂产量，能够降低松脂的生产成本，对湿地松松脂产业的提升和健康发展具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种与湿地松松脂产量相关的dna片段、其紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供的snp分子标记能够用于鉴出高产脂量湿地松，有助于提高湿地松育种的选择效率，加快湿地松育种进程。
2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
3、一种与湿地松松脂产量相关的dna片段，所述dna片段的碱基序列如seq id no.1所示，所述dna片段为湿地松松脂产量调控基因peerf的全长转录组序列。
4、snp分子标记，所述snp分子标记位于上述的湿地松松脂产量相关的dna片段的第529位，所述snp分子标记的参考碱基为t，突变后碱基为c。
5、snp分子标记的应用，所述snp分子标记为上述的snp分子标记，所述应用为用于鉴定湿地松的产脂量表型、或者用于预测湿地松产脂量的高低、或者用于湿地松产脂量的改良、或者用于湿地松的分子标记辅助育种。
6、上述的snp分子标记的应用，鉴定湿地松的产脂量表型或者预测湿地松产脂量的高低时，从待测湿地松的基因组dna中获取待测湿地松在seq id no.1所示序列的第529位处的基因型，当所述基因型为ct时，待测湿地松为高产脂量个体，当所述基因型为tt时，待测湿地松为低产脂量个体。
7、上述的snp分子标记的应用，从待测湿地松的基因组dna中获取待测湿地松在seqid no.1所示序列的第529位处的基因型时，以待测湿地松的基因组dna为模板dna进行pcr，获得pcr产物，对pcr产物进行纯化后，测序，得到待测湿地松在seq id no.1所示序列的第529位处的基因型。
8、上述的snp分子标记的应用，对待测湿地松的基因组dna进行pcr时，使用的pcr反应体系的体积为50μl，所述pcr反应体系中含有taq酶0.25μl、10×pcr buffer 5μl、dntp混合液4μl、模板dna 200ng、f引物和r引物；所述pcr反应体系中，f引物和r引物的浓度均为0.2～1.0μmol/l。
9、上述的snp分子标记的应用，f引物和r引物的序列分别如seq id no.2和seq idno.3所示。
10、上述的snp分子标记的应用，pcr时的反应程序为：94～95℃预变性3～5min；94～95℃变性15～30s，60～65℃退火和延伸40～60s，30～35个循环；65～70℃彻底延伸4～6min。
11、上述的snp分子标记的应用，pcr时的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火和延伸50s，30个循环；60℃彻底延伸4min。
12、上述的snp分子标记的应用，对pcr产物进行纯化时，依次进行琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化，其中，在进行琼脂糖凝胶电泳时，使用琼脂糖浓度为1.2wt％的琼脂糖凝胶。
13、本发明所述的产脂量为采脂24小时内收集到的松脂质量，单位为克。
14、本发明提供的湿地松松脂产量基因位点及与所述基因位点紧密连锁的分子标记的开发是基于已建立的湿地松半同胞家系群体，开展松脂产量表型的全基因组关联分析鉴定出来的。湿地松木质部全长转录本为本发明snp分子标记开发的区域。
15、本发明采用两步法pcr扩增湿地松基因片段，主要优势在于时间上的高效性、对高熔点引物的适应性以及相对简化的反应过程。而三步法虽然能够较好地控制每一步的反应条件，但其耗时较长、过程复杂且对温度控制要求较高，在实际操作中往往效率相对较低。
16、根据湿地松基因组中上述snp位点处的基因型，可较为准确地鉴定出湿地松的产脂量表型，即判断出湿地松个体是高产脂量个体还是低产脂量个体，实现高产脂湿地松的早期选择，提高育种效率。
17、从待测湿地松的基因组dna中获取待测湿地松在seq id no.1所示序列的第529位处的基因型，即对seq id no.1所示序列的第529位处的snp分子标记所处位点的基因型进行检测。检测时，可以使用常见的snp检测方法，如突变扩增阻滞系统pcr(arms pcr)、taqman探针、分子信标和测序的方法等。
18、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
19、本发明在湿地松遗传改良领域取得了显著突破，其核心贡献在于精准定位了一个对产脂性状具有显著影响的主效基因位点，该位点对湿地松产脂表型的贡献率达到了14.1％，这一发现为湿地松高产育种奠定了坚实的遗传学基础。进一步地，本发明创新性地开发了与该主效基因位点紧密连锁的snp(单核苷酸多态性)标记，这一技术工具的出现，极大地提升了湿地松高产育种的精准性与效率。
20、将该snp分子标记应用于240个母本自由授粉所得f1代群体中的240株湿地松分型结果表明：在高产脂基因型单株中，高达78.13％的个体其产脂量显著超越了群体平均水平(19.71g)，而在低产脂基因型个体中，则有78.41％的个体产脂量明显低于该平均值。这一实证数据充分验证了该snp分子标记在辅助选择高产脂湿地松单株中的高度有效性和可靠性，为快速筛选高产种质资源提供了科学依据。
21、尤为值得一提的是，相较于传统湿地松育种中依赖幼苗造林后长达10年的漫长产脂量鉴定过程，本发明所引入的snp分子标记检测方法展现出了无可比拟的优势。该方法不仅操作简便快捷，而且检测结果稳定可靠，不受外界环境因素的干扰，极大地缩短了育种周期，降低了育种成本。具体而言，通过检测所述snp分子标记所处位点的基因型，育种工作者能够在苗期便对湿地松个体进行精准的产脂性能评估与筛选，从而有效避免了资源浪费，显著提升了育种效率与成功率。
22、综上所述，本发明的实施不仅为湿地松高产育种开辟了一条全新的分子辅助选择路径，而且通过其高效、精准的snp分子标记检测手段，为加速湿地松遗传改良进程、推动林业产业的可持续发展作出了重要贡献。
1.一种与湿地松松脂产量相关的dna片段，其特征在于，所述dna片段的碱基序列如seqid no.1所示，所述dna片段为湿地松松脂产量调控基因peerf的全长转录组序列。
2.snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于如权利要求1所述的湿地松松脂产量相关的dna片段的第529位，所述snp分子标记的参考碱基为t，突变后碱基为c。
3.snp分子标记的应用，其特征在于，所述snp分子标记为如权利要求2所述的snp分子标记，所述应用为用于鉴定湿地松的产脂量表型、或者用于预测湿地松产脂量的高低、或者用于湿地松产脂量的改良、或者用于湿地松的分子标记辅助育种。
4.根据权利要求3所述的snp分子标记的应用，其特征在于，鉴定湿地松的产脂量表型或者预测湿地松产脂量的高低时，从待测湿地松的基因组dna中获取待测湿地松在seq idno.1所示序列的第529位处的基因型，当所述基因型为ct时，待测湿地松为高产脂量个体，当所述基因型为tt时，待测湿地松为低产脂量个体。
5.根据权利要求4所述的snp分子标记的应用，其特征在于，从待测湿地松的基因组dna中获取待测湿地松在seq id no.1所示序列的第529位处的基因型时，以待测湿地松的基因组dna为模板dna进行pcr，获得pcr产物，对pcr产物进行纯化后，测序，得到待测湿地松在seq id no.1所示序列的第529位处的基因型。
6.根据权利要求5所述的snp分子标记的应用，其特征在于，对待测湿地松的基因组dna进行pcr时，使用的pcr反应体系的体积为50μl，所述pcr反应体系中含有taq酶0.25μl、10×pcr buffer 5μl、dntp混合液4μl、模板dna 200ng、f引物和r引物；所述pcr反应体系中，f引物和r引物的浓度均为0.2～1.0μmo l/l。
7.根据权利要求6所述的snp分子标记的应用，其特征在于，f引物和r引物的序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。
8.根据权利要求7所述的snp分子标记的应用，其特征在于，pcr时的反应程序为：94～95℃预变性3～5min；94～95℃变性15～30s，60～65℃退火和延伸40～60s，30～35个循环；65～70℃彻底延伸4～6min。
9.根据权利要求8所述的snp分子标记的应用，其特征在于，pcr时的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火和延伸50s，30个循环；60℃彻底延伸4min。
10.根据权利要求5所述的snp分子标记的应用，其特征在于，对pcr产物进行纯化时，依次进行琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化，其中，在进行琼脂糖凝胶电泳时，使用琼脂糖浓度为1.2wt％的琼脂糖凝胶。
