本发明属于药物制剂，涉及一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊及制备方法和应用。
背景技术：
1、脑胶质瘤作为最常见的原发性恶性脑肿瘤，五年生存率小于5%。单一疗法不足以抑制其发生发展，临床一般采用放射疗法和化疗相结合的治疗方式以延长患者生存时间。放疗采用包含x射线在内的高能射线损伤dna，化疗采用dna烷化剂替莫唑胺，可以得出dna损伤是脑胶质瘤临床治疗的主要手段；但当前临床疗效并不佳，其重要原因是脑胶质瘤具有修复损伤dna的能力。因此脑胶质瘤治疗的关键点在于抑制dna的损伤修复。
2、研究表明dna损伤修复关键蛋白为brd4，其作为表观遗传调节因子，在脑胶质瘤内高表达，因此靶向brd4有望成为针对胶质瘤治疗的潜在增敏方式。但是brd4缺乏小分子抑制剂，是一种传统意义上不可成药蛋白。不同于小分子抑制剂的占位抑制原理，protac通过泛素化标记靶蛋白，能够高效降解“不可成药”目标蛋白。
3、但与此同时protac具有分子量大、溶解性、渗透性差的特点，面临入脑困难的问题，需要设计智能化递药系统进行改善。因此如何匹配脑胶质瘤的治疗困境，结合肿瘤微环境实现高效的dna损伤，是临床治疗关键科学问题；利用智能化递药系统递送protac增强dna损伤效果，是临床增敏放化疗的关键策略之一。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊及制备方法。本发明在充分考虑了脑胶质瘤的相关病理因素（包括高浓度谷胱甘肽）的前提下，首先通过选择具有高效降解目标蛋白brd4的protac药物；然后合成基于peg-聚氨基酸的高分子聚合物，将peg与色氨酸类似物通过click反应偶联、并与氨基酸聚合，制得一种生物相容性高的高分子聚合物；利用两亲性聚合物将疏水性protac药物包载进入纳米粒核心，然后利用交联反应形成纳米胶囊，增强整体制剂的稳定性，并赋予其病灶响应性能。
2、本发明首先将色氨酸类似物偶联化合物加入纳米胶囊载药系统，能够发挥其胶质瘤病灶特异性靶向配体的作用；其次，因二硫键具有谷胱甘肽响应功能，在纳米胶囊内引入二硫键基团，能够发挥其瘤内高谷胱甘肽响应功能；此外，在高谷胱甘肽作用下，纳米胶囊能够释放出protac药物，发挥高效降解蛋白和抑制肿瘤细胞的疗效，同时因谷胱甘肽大量消耗而增强氧化应激、促进活性氧损伤dna的作用。因此，本发明制备的纳米胶囊兼具gsh刺激响应性、l型氨基酸转运体1特异性识别与吞噬能力，能够克服现有抗胶质瘤疗法的不足，并实现胶质瘤病灶靶向蓄积、按需释药及增强现有胶质瘤放疗和化疗的临床效果。
3、为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
4、一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊，是由聚合物骨架材料在含二硫键的交联剂作用下交联形成的包载protac药物的纳米胶囊；
5、所述聚合物骨架材料包括聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸高分子聚合物、色氨酸类似物修饰的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸高分子聚合物；
6、所述含二硫键的交联剂为dtssp交联剂；
7、所述protac药物为sis或arv-825。
8、优选的，所述聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸高分子聚合物的化学式如式ⅰ中所示：
9、
10、式ⅰ
11、所述色氨酸类似物修饰的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸高分子聚合物的化学式如式ⅱ中所示：
12、
13、式ⅱ
14、进一步优选的，所述纳米胶囊的直径为100-110 nm；zeta电位为0-2 mv；对sis的载药量为7.0%，包封率为67.89%。
15、上述一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：
16、（1）将n6-苄氧羰基-l-赖氨酸和三光气混合后，使用氩气保护；而后加入无水四氢呋喃，50 ℃反应3 h；冷却至室温，过滤除去不溶物，将滤液缓慢滴入预冷的无水正己烷中，抽滤，收集产物，真空干燥，得到lys(cbz)-nca；
17、（2）称取l-苯丙氨酸和三光气混合后，氩气保护；之后加入无水四氢呋喃，50 ℃反应3 h；冷却至室温，过滤除去不溶物，将滤液缓慢滴入预冷的无水正己烷中，搅拌，抽滤，收集产物，真空干燥，得到phe-nca；
18、（3）将ch3o-peg112-nh2、lys(cbz)-nca使用氩气保护；之后加入无水dmf，50 ℃反应48 h，得到反应液一；phe-nca溶于无水dmf后加入所述反应液一中，50 ℃反应48 h，得到反应液二；向所述反应液二中加入乙酸酐和三乙胺的dmf溶液，室温反应3 h；反应终止后，将得到的溶液置于纯水中透析24 h；冷冻干燥后获得产物mpeg112-plys(cbz)-pphe-ch3；
19、（4）将mpeg112-plys(cbz)-pphe-ch3于搅拌下溶于三氟乙酸中，再加入hbr溶液，室温下反应1.5 h；而后，将反应体系进行透析，冷冻干燥，收集产物mpeg112-plys-pphe-ch3；
20、（5）将1-甲基-l-色氨酸分散于纯水和四氢呋喃的混合溶液中，加入naoh，搅拌溶解，滴入(boc)2o，0 ℃反应10 min，25 ℃反应24 h；蒸发溶剂，得到反应混合物；盐酸酸化反应混合物直至固体不再增多；用乙酸乙酯提取反应混合物；无水na2so4干燥有机层；蒸发有机溶剂；真空干燥得到产物boc-n-1-甲基-l-色氨酸（mlt-boc）；
21、（6）将mlt-boc、1-羟基苯并三唑（hobt）、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯（hbtu）在氩气保护下于无水dmf、冰浴中活化40 min；而后加入炔丙胺、n,n-二异丙基乙胺（dipea）的dmf溶液，温度逐渐恢复至室温，反应24 h;；在流动相为体积比90/10的二氯甲烷/乙酸乙酯柱色谱条件下分离出产物1-mlt(boc)-炔丙基；
22、（7）将n3-peg112-nh2、1-mlt(boc)-炔丙基溶于无水dmf中，而后加入cui和dipea的dmf 溶液，高纯氩气保护，最后加入抗坏血酸钠(vcna)；避光室温反应过夜，反应结束后，将反应液装入透析袋内，并置于ph为7.4的含10 mm edta-2na的pbs溶液中透析24 h，直到体系红色消失变为黄色，而后将透析袋转移到纯水中透析24 h，冷冻干燥得到淡黄色产物mlt-boc-peg112-nh2；
23、（8）将mlt-boc-peg112-nh2、lys(cbz)-nca在高纯氩气保护下溶于无水dmf中，于50℃反应48 h；而后加入phe-nca的dmf溶液中，50 ℃反应48 h；冷乙醚沉淀得到产物mlt-boc-peg112-plys(cbz)-pphe-nh2；
24、（9）将mlt-boc-peg112-plys (cbz)-pphe-nh2溶于三氟乙酸后，加入hbr，并于室温搅拌下反应1.5 h；将反应体系进行透析，冷冻干燥后得到淡黄色产物mlt-peg112-plys-pphe-nh2；
25、（10） 通过纳米沉淀法制备纳米胶囊：分别配制浓度均为20 mg/ml的mpeg112-plys-pphe-ch3、mlt-peg112- plys-pphe-nh2材料和sis药物的dmso溶液；取mpeg112-plys-pphe-ch3的dmso溶液、mlt-peg112-plys-pphe-nh2的dmso溶液和sis的dmso溶液混合；而后逐滴加入纯水中；搅拌4小时；透析12 h除去dmso，每4h换一次水，即得到mplp@sis纳米粒；将dtssp溶液加入mplp@sis纳米粒制剂，常温反应6 h，纯水透析12 h除去多余dtssp，即得mpl(ss)p@sis纳米胶囊。
26、优选的，步骤（1）中所述n6-苄氧羰基-l-赖氨酸与三光气的摩尔比为2.5 : 1。
27、优选的，步骤（2）中所述l-苯丙氨酸与三光气的摩尔比为2 : 1。
28、优选的，步骤（3）中所述lys(cbz)-nca、phe-nca与ch3o-peg-nh2，的摩尔比为12 :20 : 1;乙酸酐、三乙胺与 ch3o-peg-nh2的摩尔比为5 : 3 : 1。
29、优选的，步骤（4）中，将200 mg 所述mpeg112-plys(cbz)-pphe-ch3的固体加入10ml三氟乙酸进行溶解，再加入200 µl hbr进行反应，其中hbr为33 wt.%的乙酸溶液。
30、优选的，步骤（5）中，纯水和四氢呋喃体积比为1:1，反应物用量： 1-甲基-l-色氨酸为400 mg， (boc)2o为350 µl；naoh的浓度为1 mol/l；盐酸浓度为1mol/l。
31、优选的，步骤（6）中所述hobt和hbtu作为酰胺缩合剂，促进酰胺反应进行；dipea是缩合反应的碱性有机催化剂；mlt-boc和炔丙胺的摩尔比为1 : 1.2；mlt-boc和hobt、hbtu、dipea的摩尔比为1 : 1.1 : 1.1 : 2.4。
32、优选的，步骤（7）中所述n3-peg112-nh2和1-mlt(boc)-炔丙基的摩尔比为1:2；n3-peg112-nh2与cui、dipea、vcna的摩尔比为1 : 1 : 1 : 15；cui起到催化作用；过量vcna的作用为防止cui氧化；edta-2na透析时通过络合作用除去多余的铜离子；得到的产物mlt-boc-peg112-nh2为淡黄色。
33、优选的，步骤（8）中所述lys (cbz)-nca、phe-nca与mlt-boc-peg112-nh2的摩尔比为12 : 20 : 1。
34、优选的，步骤（9）中，将200 mg mlt-peg112-plys(cbz)-pphe-nh2的固体加入10 ml三氟乙酸进行溶解，并加入200 µl hbr进行反应，其中hbr为33 wt.%的乙酸溶液。
35、优选的，步骤（10）中所述mpeg112-plys-pphe-ch3、mlt-peg112-plys-pphe-nh2和sis的质量比为9 : 1 : 1；dtssp溶液溶剂为ph 12.1的pbs，dtssp溶液的浓度为20 mg/ml，1ml纳米粒制剂加入100 µl dtssp溶液，反应6 h，透析12 h除去多余dtssp，即得mpl(ss)p@sis纳米胶囊。
36、上述一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊在治疗胶质瘤药物中的应用。
37、透析的方法为：将所述产物置于截留分子量为3500的透析袋内，浸入水中，透析除去杂质。
38、本发明所述室温指25 ℃。
39、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
40、（1）本发明所述的纳米胶囊载体不会对机体产生明显的毒性，生物相容性良好；
41、（2）本发明制备的纳米胶囊粒径较小，形貌均匀，胶囊骨架可与gsh反应而具有病灶响应性并释放药物；
42、（3）本发明制备的纳米胶囊可作为治疗胶质瘤的纳米药物，并适于血管内注射给药；纳米胶囊可借助色氨酸类似物，靶向至l型氨基酸转运体1并跨越血脑屏障，富集到胶质瘤病灶；在胶质瘤病灶高浓度谷胱甘肽刺激下，纳米胶囊选择性释放protac药物，发挥降解靶蛋白的作用；同时纳米胶囊载体增强活性氧水平，能够发挥增强dna损伤的作用。
1.一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊，其特征在于，是由聚合物骨架材料在含二硫键的交联剂作用下交联形成的包载protac药物的纳米胶囊；
2.根据权利要求1所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊，其特征在于，所述聚乙二醇-聚赖氨酸-聚苯丙氨酸高分子聚合物的化学式如式ⅰ中所示：
3.根据权利要求1或2所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述n6-苄氧羰基-l-赖氨酸与三光气的摩尔比为2.5 : 1；
5. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，将200 mg 所述mpeg112-plys(cbz)-pphe-ch3的固体加入10 ml三氟乙酸进行溶解，再加入200 µl hbr进行反应，其中hbr为33 wt.%的乙酸溶液；优选的，步骤（5）中，纯水和四氢呋喃体积比为1 : 1，反应物用量： 1-甲基-l-色氨酸为400 mg， (boc)2o为350 µl；naoh的浓度为1 mol/l；盐酸浓度为1mol/l。
6. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（6）中mlt-boc和炔丙胺的摩尔比为1 : 1.2；mlt-boc和hobt、hbtu、dipea的摩尔比为1 : 1.1 : 1.1 : 2.4；
7. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（8）中所述lys (cbz)-nca、phe-nca与mlt-boc-peg112-nh2的摩尔比为12 : 20 :1。
8. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（9）中，将200 mg mlt-peg112-plys(cbz)-pphe-nh2的固体加入10 ml三氟乙酸进行溶解，并加入200 µl hbr进行反应，其中hbr为33 wt.%的乙酸溶液。
9. 根据权利要求3所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（10）中所述mpeg112-plys-pphe-ch3、mlt-peg112-plys-pphe-nh2和sis的质量比为9 : 1 : 1；dtssp溶液溶剂为ph 12.1的pbs，dtssp溶液的浓度为20 mg/ml，1 ml纳米粒制剂加入100 µl dtssp溶液，反应6 h，透析12 h除去多余dtssp，即得mpl(ss)p@sis纳米胶囊。
10.根据权利要求1或2所述的一种递送protac的刺激响应型纳米胶囊在治疗胶质瘤药物中的应用。
