本发明属于分析化学领域，具体涉及一种利用气相色谱质谱法快速检测畜肉中吲哚乙酸的方法及其应用。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、吲哚乙酸是色氨酸在生物体内的一种代谢产物，哺乳动物组织和肠道微生物均可将色氨酸分解为吲哚乙酸。在动物体内，吲哚乙酸主要功能有：抗氧化应激、抗炎和介导细胞凋亡的作用。目前吲哚乙酸的分析研究主要集中在动物体内作用及代谢方面，在畜肉中的检测方法还未有报道，因此迫切需要开发针对畜肉中吲哚乙酸的精准检测技术。
3、吲哚乙酸的检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法等。液相色谱分析多在强酸条件下进行，但强酸条件会影响色谱柱的性能。吲哚乙酸可经过衍生化反应，使其转化为极性较小的衍生物进行气相色谱质谱分析检测。但是，常见的衍生化试剂存在一些缺陷：重氮甲烷虽然快速但毒性高且制作复杂；10%三氟化硼甲醇和10%三氟化硼乙醚价格昂贵，实验成本高等。此外，畜肉基质复杂，通常含有较多的油脂、脂肪等杂质，常见前处理技术有固相萃取法、凝胶渗透色谱法和冷冻除脂法等，前2种方法存在前处理过程复杂、有机溶剂消耗大等问题，冷冻除脂法虽然简便，但需要较长的冷冻时间和低温条件。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种利用气相色谱质谱法快速检测畜肉中吲哚乙酸的方法。所述方法具有提取效率高，净化速度快，衍生化时间短等优点。
2、本发明的第二个目的在于提供上述方法的应用，所述方法可用于检测畜肉中吲哚乙酸的含量。
3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
4、一种利用气相色谱质谱法快速检测畜肉中吲哚乙酸的方法，所述方法包括如下步骤：
5、（1）样品的制备和提取：称取粉碎后的畜肉样品5 g，加入10 ml水，调节ph值，加入20 ml提取液，加入2~4 g氯化钠，涡旋5 min，8000 r/min，离心3 min，上清液即为提取液；
6、（2）利用sinchers净化柱进行净化并浓缩：将sinchers净化柱垂直插入步骤（1）的提取液中，缓慢下压净化柱顶部。sinchers净化柱中得到净化液，准确移取净化液4 ml到15ml离心管中，40℃条件下氮气吹干，得到浓缩液；
7、（3）快速衍生化和衍生化产物的提取：向步骤（2）得到的浓缩液中加入200 μl浓硫酸甲醇混合溶液，涡旋1 min；加入1.0 ml正己烷，涡旋1 min；再加入0.5 ml饱和氯化钠溶液，涡旋0.5 min，静置分层；上层清液过0.22 μm有机相滤膜，得到分析液；
8、（4）气相色谱质谱分析：取步骤（3）中分析液通过气相色谱质谱仪进行分析；
9、（5）标准工作曲线的制定和定量分析：取空白样品，按照步骤(1)~(2)处理，分别向空白样品的浓缩液中加入不同体积的标准溶液，氮气吹干后按照步骤(3)处理，配制不同浓度的基质标准溶液，再进行气相色谱质谱分析，将得到的目标物的峰面积与相应的浓度进行线性分析，计算得出吲哚乙酸的标准工作曲线以及回归方程，将样品提取液检测后得到的吲哚乙酸的峰面积带入相应的回归方程中，得到样品提取液中吲哚乙酸的浓度，计算得出样品中吲哚乙酸的含量。
10、进一步地，步骤（1）中，所述样品为猪肉、牛肉或羊肉，调节ph值为1~6。
11、进一步地，步骤（1）中，所述提取液为乙醚、乙醇、丙酮或乙腈。
12、进一步地，步骤（2）中，所述sinchers净化柱为sp1101、sp1201、sp1501或sp1601净化柱。
13、进一步地，步骤（3）中，所述浓硫酸甲醇混合溶液由浓硫酸和甲醇按照体积比为1：4组成。
14、进一步地，步骤（3）中，所述涡旋的时间为1 min。
15、进一步地，步骤（4）中，气相色谱的条件：hp-5ms毛细管色谱柱，30 m×250 μm×0.25 μm；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μl；载气：高纯氦气，纯度99.999%，流速：1 ml/min；程序升温条件：初始温度120℃，保持1 min；以10℃/min升至150℃；以5℃/min升至280℃，保持2.5 min。
16、进一步地，质谱的条件：离子源温度：300℃；传输线温度：280℃；四极杆温度：180℃；电离能量：70 ev；溶剂延迟：5 min；监测方式：选择离子监测模式。
17、上述方法的应用，所述方法可用于快速检测肉制品中吲哚乙酸的含量。
18、本发明调节样品溶液ph值为1~6，加入提取液提取样品，采用sinchers净化柱净化，氮气吹干后加入200 μl浓硫酸甲醇溶液涡旋辅助条件下衍生化1 min，正己烷提取衍生化产物，加入用饱和氯化钠溶液净化，经气相色谱-质谱法ei源测定。这种方法的优点是操作简便，萃取效率高，净化速度快，衍生化高效快速，溶剂消耗少，是一种绿色环保的样品前处理方法。
19、本发明建立了气相色谱质谱法快速检测肉制品中吲哚乙酸的含量的方法。本发明对样品加水与不加水，ph值、提取溶液种类、sinchers净化柱、浓硫酸与甲醇的体积及衍生化时间等进行了考察。结果表明，吲哚乙酸在0.01~5.0 ug/ml范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。本发明所采用的方法检出限为0.003 mg/kg，定量限为0.01 mg/kg。空白样品在3个添加水平下（0.01、0.05、0.1 mg/kg）的平均回收率为92.1%~102.1%，相对标准偏差（n=6）为2.6%~5.7%。本发明提供的方法衍生化步骤简单、灵敏度高、前处理时间短，可用于畜肉中吲哚乙酸的快速测定。
20、有益效果：
21、（1）填补空白
22、吲哚乙酸的研究主要集中在植物源食品上，其在畜肉中的检测方法还未有报道。本方法检出限可达0.003 mg/kg，定量限可达0.01 mg/kg，填补了畜肉中吲哚乙酸质量标准的空白，可辅助吲哚乙酸在动物体内作用及代谢方面的研究。
23、（2）操作简便、快捷
24、本方法采用浓硫酸甲醇溶液在涡旋辅助条件下进行衍生化反应，反应仅需1 min即可完成。本方法采用推针式sinchers净化柱，完成1个样品的净化耗时5 s。1个样品前处理只需15 min左右，大大缩短了样品检验时间，提高了工作效率。
25、（3）绿色、环保
26、本方法衍生化试剂仅需200 μl，采用sinchers净化柱净化无需活化和平衡，减少了有机试剂的使用。衍生化试剂为浓硫酸和甲醇溶液，衍生化产物净化选择饱和氯化钠溶液，试剂易得且成本低。本发明大大降低了有机试剂的用量，对环境更加绿色、友好。
27、本发明具有简单、快速、绿色，成本低等优势，适合畜肉中吲哚乙酸快速检测，具有较强的应用价值。
1.一种利用气相色谱质谱法快速检测畜肉中吲哚乙酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述样品为猪肉、牛肉或羊肉，调节ph值至1~6；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述样品、氯化钠、水和提取液的质量体积比为5 g：2 g：10 ml：20 ml；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，sinchers净化柱为sp1101、sp1201、sp1501或sp1601净化柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述浓硫酸甲醇混合溶液由浓硫酸和甲醇按照体积比为1：4组成；所述涡旋的时间为1 min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述净化液和步骤（3）中所述浓硫酸甲醇混合溶液的体积比为4 ml：200 μl；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中加入正己烷后涡旋1 min，再加入饱和氯化钠溶液后涡旋0.5 min，静置分层。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，气相色谱条件：hp-5ms毛细管色谱柱，30 m×250 μm×0.25 μm；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μl；载气：高纯氦气，纯度99.999%，流速：1 ml/min；程序升温条件：初始温度120℃，保持1min；以10℃/min升至150℃；以5℃/min升至280℃，保持2.5 min；
9.权利要求1-8任一项所述的方法的应用，其特征在于，所述方法用于快速检测畜肉中吲哚乙酸的含量。
