本公开总体上涉及用于以高度多重化方式对多个靶进行数字计数的系统、方法和组合物。
背景技术：
1、以多重化方式检测靶材料有助于快速生成诊断结果。用于标记多个遗传靶和/或变异体(诸如单核苷酸多态性(snp)、拷贝数变异(cnv)、插入、缺失和/或其他目的基因座、甲基化标记物、基因表达标记物、小和微小rna标记物、基因组修饰标记物和其他标记物)的组合物和方法可以有助于诊断的产生和/或支持测定结果的解释，其可以用于提供医疗保健或以其他方式改进其他目的领域中的结果。靶的多重化检测还可以在研究或其他非临床环境中提供价值，无论是否对活的人或哺乳动物的生物材料进行评估和处理，并且不直接以获得疾病或健康状况的诊断结果为目的。
2、在应用中，通过基因分型的多个靶的数字定量可以进一步用于许多领域中的表征(例如，对相对丰度的表征)。然而，用于使用基于分区的系统(例如，如在数字pcr中的基于分区的系统)对多个靶进行检测和数字定量的多重化传统上受可用分区的数量、分区格式(例如，3d格式与1d或2d格式)、可用于分析以进行检测的颜色的数量(例如，与染料/探针标记限制相关，与成像子系统的检测限制相关等)、高设备成本、要求统计误差校正因子以用于结果评估的高占有率状态下的操作、材料成本、以及其他因素的限制。例如，在传统的pcr多重化反应中，通过每个靶使用一个与具有不同激发和发射光谱的染料缀合的探针，来区分靶，这将多重化限制于可以处理多个发射光谱以用于检测来自不同探针染料的荧光的系统。此外，与高占有率状态下的操作相关联的信号重叠通常导致定量和样品表征的其他方面的精度降低。此类传统方法包括用于补偿缺陷的方法(例如，利用涉及虚拟分区的计算工具)。
3、此外，多重化的方法已经基于创建用于检测的独特端点(例如，关于通过独特探针和/或引物来标记，随后进行反应和检测)，其中对所标记的靶进行基于信号振幅的区分。更详细地，基于振幅的多重化通过改变引物和/或探针浓度以产生用于靶检测的独特端点来实现独特端点，并且探针混合的多重化通过在由特定模态对信号进行检测之后以所希望的浓度混合探针以便分离靶簇(在多轴图中)来实现独特端点。然而，现有方法的限制可以通过以下章节中描述的本公开的系统、方法和组合物来克服。
4、因此，在与用于靶的多重化检测和定量的系统、组合物和方法相关的领域中需要创新。
技术实现思路
1、目前，用于执行多重化分析的平台、方法和组合物涉及显著的基础设施投资(例如，关于微流体平台和检测平台方面)；然而，此类技术在以下方面是受限的：可以被同时检测的靶的数量；通过其区别地检测不同靶的机制(例如，如在涉及主要基于信号振幅的检测机制中)；对其中分区以批量形式(例如，以三维中的堆积配置)被三维(3d)布置的分区技术提供具有高准确度的多重化性能的能力；对涉及用于数字分析的极高数量的分区(例如，大于1百万个分区)的分区技术提供多重化的能力；以及在多维数字分析的背景下的其他因素。
2、因此，本公开描述了用于以高性能、高效和准确的方式，使用不太复杂的仪器对大量靶进行数字检测的系统、方法和组合物的实施方案、变型和示例。
3、本公开的一个方面提供了用于实施涉及颜色组合、刺激响应探针、串联探针、缀合聚合物探针以及用于增加可以在数字测定中被同时检测的靶的数量的其他机制的高度多重化分子诊断测定的组合物、方法和系统。如以下更详细描述的，机制的组合可以提供可以根据n！/[r！(n-r)！]被区别地检测的多个靶，其中n表示可用颜色的数量，并且r表示从所述数量的可用颜色中选择的颜色的数量。机制的排列可以提供可以根据n！/[(n-r)！]+n被区别地检测的多个靶，其中n表示可用颜色的数量，并且r表示从所述数量的可用颜色中选择的颜色的数量。在示例中，可以从单一样品区别地标记和检测并且在单一测定内运行的靶的数量可以是大于10个靶、大于15个靶、大于20个靶、大于25个靶、大于30个靶、大于35个靶、大于40个靶、大于45个靶、大于50个靶、大于55个靶、大于60个靶、大于65个靶、大于70个靶、大于75个靶、大于80个靶、大于85个靶、大于90个靶或大于100个靶，其中对来自靶的信号进行光学检测。
4、区别地检测部分地由于当使用所述技术时所涉及的大量分区而实现，其中样品靶跨分区的分布导致由靶对分区的低占有率，并且大的分区数量有助于双联体(例如，由两个靶占有的单分区)、三联体(例如，由三个靶占有的单分区)或其他形式的多联体(由多个靶占有的单分区)的显著低百分比。特别地，在此水平上成功的多重化归因于高度的分区(描述了可实现的生成分区数)和极低的占有率(描述了可实现的占有率百分比)，使得来自目的靶分子的多个分子与另一个靶分子占据相同分区的概率最小(或为零)。在这种高分区和低占有率状态下，不存在与每个分区多个靶分子相关的竞争，并且平台不会遇到与不同靶分子之间的pcr效率差异相关的问题。
5、在数字多重化分析的背景下，本公开还提供了由于所涉及的分区数量和样品的靶对分区的占有率而可以实现高动态范围的系统、方法和组合物。在示例中，对于所述的样品体积，系统、方法和组合物可以提供以下动态范围：从较低计数能力到较高计数能力的超过4个数量级(例如，至少104)、从较低计数能力到较高计数能力的超过5个数量级(例如，至少105)、从较低计数能力到较高计数能力的超过6个数量级(例如，至少106)、从较低计数能力到较高计数能力的超过7个数量级(例如，至少107)或更大。在示例中，对于所述的样品体积，系统、方法和组合物可以在超过4-对数(4-log)的动态范围、超过5-对数的动态范围、超过6-对数的动态范围、超过7-对数的动态范围或更大的范围内实现对靶的定量。
6、对于批量(例如，以密堆积的形式，以乳液的液滴的形式)布置在封闭容器内的分区，所述系统、方法和组合物可以提供来自单个分区的可辨别信号，其中使用与检测中所涉及的光源和光学器件对应的多个颜色通道(例如，2个颜色通道、3个颜色通道、4个颜色通道、5个颜色通道、6个颜色通道、7个颜色通道等)来执行读出，并且具有与背景荧光相关的合适的信噪比(snr)特征。
7、对于多重化分析，所述方法涉及检测来自大量分区的信号，其中检测到的信号对应于颜色组合集，所述颜色组合集与在样品中潜在地表示且包含在分区集中的分区内的靶集中的靶配对，并且其中靶集的总数量大于用于检测与颜色组合集对应的颜色的颜色通道的数量。在示例中，颜色组合集涉及多达3种颜色、多达4种颜色、多达5种颜色、多达6种颜色、多达7种颜色或更多种颜色(来自分区集中的每一个区)的组合，其中颜色的每个组合具有与相应组合相关联的对应靶。
8、在一个实施方案中，分区集涉及在封闭容器内的乳液的液滴，并且颜色组合集涉及从分区集中的每一个分区可检测到的多达3种颜色、多达4种颜色、多达5种颜色、多达6种颜色、多达7种颜色等的组合。附加地或可替代地，涉及刺激响应材料的多重化可以通过等于用来标记靶的探针可以通过其转变的状态的数量的因子来扩大可以被区别地标记和检测的靶的数量。附加地或可替代地，涉及表现出foerster共振能量转移(fret)行为的材料的多重化可以通过等于所使用的有fret能力的探针的数量的因子来扩大可以被区别地标记和检测的靶的数量。
9、关于以下所述的用于以3d形式批量布置的分区的检测技术(例如，基于光片成像等)，本公开还提供了产生具有降低背景的显著改进的信噪比(snr)值的组合物。在示例中，靶信号可以至少比背景噪声信号大102、比背景噪声信号大103、比背景噪声信号大104、比背景噪声信号大105、比背景噪声信号大106、比背景噪声信号大107、或更好。背景噪声可以归因于在乳液数字pcr的背景下来自相邻分区和分区平面集中的相邻平面的荧光，或归因于具有紧密定位的分区的其他来源。
10、在与所述的用于液滴数字pcr的反应材料相关联的示例中，确定靶信号值可以包括：对于被询问(例如，通过光片检测、通过另一种检测方法等)的分区平面集中的每个平面：基于在相应平面中表示的正分区的轮廓确定分类；确定特异于所述轮廓的靶信号分布和噪声信号分布；以及对于相应平面，确定靶信号强度和噪声信号强度。这里，靶信号值可以是根据平面集确定的靶信号强度的平均值(或其他代表值)，并且背景噪声信号值可以是根据平面集确定的噪声信号强度的平均值(或其他代表值)。
11、本公开还提供了用于多重化测定(例如，锁核酸(lna)测定、kasp测定、taqman测定等)的寡核苷酸组合物和设计。此类经改善的寡核苷酸改善了样品处理，涉及引物清除/去除、背景降低、用于直接多重化测定(例如，pcr)的相容正向和反向引物的实施、检查扩增子与非自身探针的互补性(即，在有义和反义链两者中)的实施、检查引物与探针的互补性(即，在有义和反义链两者中)的实施、临床工作流程的阳性和阴性对照的产生、niptultrapcr测定的检测限(lod)和其他指标的建立，和/或其他改善。
12、分区产生方法的示例可以包括在具有一定体积容量(例如，小于50微升、50至100微升和更大等)的收集容器内产生极高数量的液滴(例如，大于500万个液滴、大于600万个液滴、大于700万个液滴、大于800万个液滴、大于900万个液滴、大于1000万个液滴、大于1500万个液滴、大于2000万个液滴、大于2500万个液滴、大于3000万个液滴、大于4000万个液滴、大于5000万个液滴、大于1亿个液滴等)，其中液滴具有与数字分析、靶检测、单个分子分区或其他应用相关的特征尺寸(例如，从1-50微米、从10-50微米等)。
13、关于占有率，分区的实施方案、变型和示例以使得每个分区具有一个或零个分子的方式实施，使得分区被表征为具有低占有率(例如，单个分子对分区的占有率小于15％、单个分子对分区的占有率小于14％、单个分子对分区的占有率小于13％、单个分子对分区的占有率小于12％、单个分子对分区的占有率小于11％、单个分子对分区的占有率小于10％、单个分子对分区的占有率小于9％、单个分子对分区的占有率小于8％、单个分子对分区的占有率小于7％、单个分子对分区的占有率小于6％、单个分子对分区的占有率小于5％、单个分子对分区的占有率小于4％等)。
14、在示例中，所述系统、方法和组合物可以用于：对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶50,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶60,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶70,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶80,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶90,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶100,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶120,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶130,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶140,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每个靶150,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶160,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶170,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶180,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶190,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶200,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶210,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶220,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶230,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶240,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶250,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶260,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶270,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶280,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶290,000个计数；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶300,000个计数或；对于目的靶集中的每一个靶，产生每靶其他个计数。
15、所述组合物、方法和系统可以进一步涉及具有串联衔接子的单个引物或用于使用探针标记靶的多个引物的使用。可以使用被构造成位于对不同靶进行编码的靶特异性探针的侧翼的多重化引物。多重化引物组合物可以被配置成用于：对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行20重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行30重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行40重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行50重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行60重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行70重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行80重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行90重扩增、对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行100重扩增、或对被分析的靶集中的每一个靶的目的基因座进行更大的扩增。
16、相关地，本公开的一个方面提供了用于快速产生分区(例如，来自样品流体的液滴、乳液的液滴)并跨分区分布核酸材料(例如，多重化靶检测)的装置和方法的实施方案、变型和示例，其中，所述装置包括：第一基材，其限定包括储存器入口和储存器出口的储存器；膜，其偶联到储存器出口并包括孔分布；以及支撑体，其包括开口，开口被配置成保持收集容器与储存器出口对齐。在操作过程中，第一基材可以与支撑体偶联并包围收集容器，其中储存器出口与收集容器对齐和/或位于收集容器内。在操作过程中，储存器可以含有样品流体(例如，样品的核酸和用于扩增反应的材料的混合物)，其中对装置或样品流体施加的力以极高的速率在收集容器内产生多个液滴(例如，至少200,000个液滴/分钟、至少300,000个液滴/分钟、至少400,个液滴/分钟、至少500,000个液滴/分钟、至少600,000个液滴/分钟、至少700,000个液滴/分钟、至少800,000个液滴/分钟、至少900,000个液滴/分钟、至少100万个液滴/分钟、至少200万个液滴/分钟、至少300万个液滴/分钟、至少400万个液滴/分钟、至少500万个液滴/分钟、至少600万个液滴/分钟等)，其中液滴在收集容器内稳定在适当位置(例如，以密堆积形式、在平衡静止位置)中。
17、本公开的一个方面提供了用于在收集容器内以极高的速率快速产生分区(例如，来自样品流体的液滴、乳液的液滴)的方法的实施方案、变型和示例，多个液滴中的每一个包括用于数字分析的水性混合物，其中在产生后，多个液滴在连续相中(例如，作为具有由收集容器限定的整体形态的乳液)稳定在适当位置(例如，以密堆积形式、在平衡静止位置等)中。在一些方面，可以通过驱动样品流体通过膜的孔分布来执行分区产生，其中施加的力可以是离心力(例如，在离心力的作用下)、与施加的压力相关联的力、磁力或以其他方式物理施加的力中的一种或多种。
18、关于单管工作流程，其中收集容器保持封闭(例如，收集容器没有出口，没有流体流出收集容器，以避免样品污染)，方法可以进一步包括根据测定方案将热传递到封闭的收集容器内的多个液滴，以及从封闭的收集容器内的多个液滴传递热。关于具有合适澄清度(例如，具有或不具有折射率匹配)的乳液的产生，方法可以进一步包括传输来自封闭的收集容器内的单个液滴的信号，用于读出(例如，通过光学检测平台、通过另一合适的检测平台)。
19、当方法包括将热传递到封闭的容器内的多个液滴，以及从封闭的容器内的多个液滴传递热时，液滴在与各种数字分析和其他生物测定相关的宽温度范围内(例如，1℃至95℃、大于95℃、小于1℃)是稳定的，其中液滴在形态上保持一致，并且保持不与相邻液滴融合。
20、本公开总体上提供了用于有效捕获、分布和标记靶材料(例如，dna、rna、mirna、蛋白质、小分子、单分析物、多分析物等)的机制，以便能够针对各种应用以并行的和多重化的方式对材料进行基因组、蛋白质组和/或其他多组学表征。
21、在示例中，所讨论的方法围绕简单的工作流程设计，以能够部署到本地的和分散式实验室。首先，为了方便用户并最小化样品污染，使样品在同一个pcr管中首尾相连。其次，超分区和pcr扩增可以在标准实验室设备(诸如摆动桶离心机和热循环仪)中进行，降低采用ultrapcr的基础设施成本。然而，本公开的组合物还可以与用于以单分子形式分离材料的各种技术(例如，通过使用孔、通过使用液滴、通过使用其他分区元件等)协同使用。
22、本公开的另一方面提供了一种包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现上述或本文其他地方的任何方法。
23、本公开提供了用于靶的多重化检测的组合物、方法和系统，靶的多重化检测可以在研究或其他非临床环境中提供价值，无论是否对活的人或哺乳动物的生物材料进行评估和处理，并且不直接以获得疾病或健康状况的诊断结果为目的。
24、本公开的另一方面提供了一种包括一个或多个计算机处理器和与其偶联的计算机存储器的系统。计算机存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现上述或本文其他地方的任何方法。
25、根据以下具体实施方式，本公开的附加的方面和优点对于本领域技术人员将显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。本公开能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不背离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
26、援引并入
27、本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都出于所有目的以引用的方式全文并入本文，其程度如同明确且单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请都以引用的方式并入一般。
28、此外，在提供值的范围的情况下，应理解此范围的上限与下限之间的各中间值，以及此陈述范围内的任何其他陈述值或中间值涵盖在本公开内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本公开内，受制于所述范围内任何特别排除的限值。在陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开内。
29、附图说明
30、图1a描绘了用于靶的多重化检测和数字定量的方法的实施方案的流程图。
31、图1b描绘了用于靶的多重化检测和数字定量的方法的变型的流程图，应用于表征来自样品的非自身遗传物质。
32、图1c描绘了用于靶的多重化检测和数字定量的方法的变型的流程图，应用于表征样品中的胎儿分数。
33、图1d描绘了用于靶的多重化检测和数字定量的方法的实施方案的部分的流程图。
34、图2描绘了用于靶的多重化检测的方法的实施方案中实施的组分的示意图。
35、图3a描绘了使用低分区系统和与之相比的高分区系统所产生的在多重化方面的差异的示意图。
36、图3b描绘了根据本公开的实施方案的使用一个或多个探针标记靶的不同策略的示意图。
37、图3c描绘了用于靶的区别检测和定量的示例颜色组合的示意图。
38、图3d描绘了用于靶的区别检测和定量的示例颜色组合的示意图。
39、图3e描绘了根据本公开的实施方案的乳液的示意图，其中以涉及颜色组合的方式标记分区内的靶。
40、图3f描绘了与荧光团和猝灭剂的定位有关的、使用串联探针标记靶的变型。
41、图3g描绘了根据本公开的实施方案的涉及使用串联探针和涉及两种颜色的信号的基于振幅的差异的场景。
42、图3h描绘了使用单个探针或串联探针标记样品的不同靶的变型。
43、图3i描绘了涉及能够进行fret行为的探针的多重化的变型。
44、图3j描绘了有fret能力的探针的示例的示意图。
45、图3k描绘了用于标记和检测不同靶的刺激响应探针的示例的示意图。
46、图4a描绘了用探针和检测到的颜色的组合和排列可实现的多重化水平的示意图。
47、图4b描绘了展示使用多重化策略的组合来扩大用于测定的多重化能力的示意图。
48、图5a描绘了用于以多重化方式执行靶的区别检测和量化的替代测定化学品。
49、图5b描绘了用于确定用于数字多重化分析的实施方案的信噪比(snr)的过程的实施方案。
50、图6描绘了用于样品分区的系统的实施方案的示意图。
51、图7描绘了用于检测多重化组中的一个靶的方法的实施方案的部分的示意图。
52、图8描绘了有关靶的数字定量(例如，其中靶的数量大于荧光通道的数量)的示意图。
53、图9示出了被编程或以其他方式被配置成实现本文所提供的方法的计算机系统。
1.一种方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述数字多重化分析具有至少106的动态范围。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述分区集包括在所述封闭容器内的乳液的液滴，并且其中所述颜色组合集包括从所述分区集中的每一个分区可检测到的多达6种颜色的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中对于所述靶集中的靶，所述加工材料集包括：
5.如权利要求4所述的方法，其中所述靶特异性引物集进一步包括第二靶特异性引物，所述第二靶特异性引物包括第二侧翼序列，并且所述加工材料集进一步包括第二荧光团标记的寡核苷酸，所述第二荧光团标记的寡核苷酸对应于所述第二侧翼序列，所述第二荧光团标记的寡核苷酸包括第二荧光团，所述第二荧光团被配置成如果所述靶区域扩增则传输第二靶信号，使得能够基于所述第一靶信号和所述第二靶信号明确地检测到所述靶。
6.如权利要求1所述的方法，其中对于所述靶集中的靶，所述加工材料集包括：
7.如权利要求6所述的方法，进一步包括在用第一波长分布的光激发所述第一荧光团时引起从所述第一荧光团到所述第二荧光团的foerster共振能量转移(fret)，其中用所述多个颜色通道检测来自所述分区集的信号包括：在用与所述第二荧光团的发射光谱对应的第二波长分布的光扫描所述分区集时检测来自分区的所述靶。
8.如权利要求1所述的方法，其中对于所述靶集中的第一靶和第二靶，所述加工材料集包括：
9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一荧光团是可光漂白的荧光团，并且其中检测来自所述分区集的信号包括用第一波长范围的光和被配置成漂白所述第一荧光团的第二波长范围的光扫描所述分区集，所述方法进一步包括：
10.如权利要求1所述的方法，其中对于所述靶集中的第一靶和第二靶，所述加工材料集包括：引物集，所述引物集包括：被构造成用具有第一荧光团的第一探针标记所述第一靶的第一引物和被构造成用具有第二荧光团的第二探针标记所述第二靶的第二引物，其中所述第一荧光团是可光漂白的荧光团，并且其中检测来自所述分区集的信号包括用第一波长范围的光和被配置成漂白所述第一荧光团的第二波长范围的光扫描所述分区集，从而使得能够区别地检测所述第一靶和所述第二靶。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述加工材料集进一步包括被构造成降低背景噪声的探针添加剂试剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述探针添加剂试剂包括具有大于55℃的解链温度的探针添加剂。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述探针添加剂试剂包括猝灭剂，所述猝灭剂被构造成与第一荧光团标记的寡核苷酸的3'区域和5'区域中的至少一个相互作用。
14.如权利要求1所述的方法，其中执行所述组过程包括在进行以下步骤时确定所述snr：
15.如权利要求14所述的方法，
16.如权利要求15所述的方法，其中所述分类集对应于在所述平面集中可观察到的信号正分区的轮廓集中的不同轮廓。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述噪声信号值归因于来自相邻分区和所述平面集中的相邻平面的荧光。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述分区集包括大于500,000个分区，并且其中所述分区集的特征在于所述生物靶对分区的占有率小于15％。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述加工材料集包括非水解探针集，所述方法进一步包括用所述非水解探针集的排列集标记所述靶集，其中检测来自所述分区集的信号包括检测对应于所述排列集的信号，以用于区别地检测所述靶集。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述加工材料集包括水解探针集，所述方法进一步包括用所述水解探针集的组合集标记所述靶集，其中检测来自所述分区集的信号包括检测对应于所述组合集的信号，以用于区别地检测所述靶集。
21.如权利要求1所述的方法，进一步包括：基于定量分析，返回支持病原体检测、无创产前测试、器官移植分析、法医学以及肿瘤学中的至少一种的输出。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述靶集包括16s rrna和its rrna中的至少一个的高变区域。
