本发明涉及高产3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的基因修饰微生物、以及使用了该基因修饰微生物的3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法。
背景技术：
1、3-羟基己二酸(iupac名：3-hydroxyhexanedioic acid)是碳原子数为6的二羧酸。它们可以用作与多元醇聚合而形成聚酯、或与多元胺聚合而形成聚酰胺的原料。另外，通过在它们的末端加成氨而内酰胺化的化合物也可以用作聚酰胺的原料。
2、3-氧代己二酸(别名：β-酮己二酸、iupac名：3-oxohexanedioicacid)是碳原子数为6、分子量为160.12的二羧酸。3-氧代己二酸可以用作与多元醇聚合而形成聚酯、或与多元胺聚合而形成聚酰胺的原料。另外，也可以通过在3-氧代己二酸的末端加成氨而内酰胺化从而单独作为聚酰胺的原料。
3、作为与利用微生物制造3-羟基己二酸或3-氧代己二酸有关的文献，专利文献1中公开了使用对从琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa的反应进行催化的酶活性得以强化了的沙雷氏菌(serratia)属微生物制造3-羟基己二酸的方法，另外，专利文献2中报告了在利用以琥珀酰-coa和乙酰-coa作为起始原料的天然不存在的微生物制造己二酸的方法的过程中，可以生成作为己二酸生物合成路径的中间体的3-氧代己二酸(3-oxoadipic)。
4、另外，在利用微生物制造化学品的方法中，利用了将制造对象的化学品从细胞排出的排出载体(转运蛋白transporter)(例如，专利文献3及非专利文献1和2)，专利文献4中记载了使用使二羧酸排出载体的功能缺损或降低了的基因修饰微生物制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的方法，作为这些物质的生物合成路径，记载了经由将琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa转换的酶反应，并且使二羧酸排出载体的功能缺损或降低来提高这些物质的生产率。
5、现有技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：wo2017/209102号
8、专利文献2：wo2009/151728号
9、专利文献3：日本特表2017-528126号公报
10、专利文献4：wo2021/187533号
11、非专利文献
12、非专利文献1：j.ind.microbiol biotechnol.2012apr；39(4):641-7
13、非专利文献2：pesticide biochemistry and physiology 140(2017)65-68
技术实现思路
1、发明所要解决的课题
2、本发明的目的在于创造出能够以高生产率制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的基因修饰微生物以及使用了该基因修饰微生物的3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法。
3、用于解决课题的手段
4、为了实现上述目的，本发明人进行了深入研究，结果发现：在具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物中，通过增大与3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸完全不相关的物质即有机磷酸化合物的排出载体的表达量，可以提高3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的生产率，从而完成了本发明。
5、即，本发明提供以下(1)～(13)。
6、(1)一种基因修饰微生物，其强化了在具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物中对从琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa的反应进行催化的酶的活性，并且增大了有机磷酸化合物排出载体的表达量。
7、(2)根据(1)所述的基因修饰微生物，其中，所述有机磷酸化合物排出载体为磷酸丝氨酸排出载体和/或草甘膦排出载体。
8、(3)根据(1)或(2)所述的基因修饰微生物，其中，所述有机磷酸化合物排出载体为yhhs、mdtd、rhtb、mfs40或它们的同源物。
9、(4)根据(1)至(3)中任一项所述的基因修饰微生物，通过导入对以下(a)～(c)中任一项的多肽进行编码的基因，从而增大了所述有机磷酸化合物排出载体的表达量，
10、(a)由序列号1、3、28～30、46、48或50的氨基酸序列构成的多肽；
11、(b)相对于序列号1、3、28～30、46、48或50的氨基酸序列具有60％以上的序列一致性，并且具有提高3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的生产率的功能的多肽；
12、(c)由在序列号1、3、28～30、46、48或50的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或添加后的氨基酸序列构成的、并且具有提高3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的生产率的功能的多肽。
13、(5)根据(1)至(4)中任一项所述的基因修饰微生物，还强化了对将3-氧代己二酰-coa还原而生成3-羟基己二酰-coa的反应和/或从3-羟基己二酰-coa生成3-羟基己二酸的反应进行催化的酶的活性。
14、(6)根据(1)至(5)中任一项所述的基因修饰微生物，还强化了对从3-氧代己二酰-coa生成3-氧代己二酸的反应进行催化的酶的活性。
15、(7)根据(1)至(6)中任一项所述的基因修饰微生物，其中，所述微生物为属于大肠杆菌(escherichia)属或沙雷氏菌(serratia)属的微生物。
16、(8)一种3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法，包括对(1)至(7)中任一项所述的基因修饰微生物进行培养的工序。
17、(9)一种基因修饰微生物的制造方法，包括：利用基因修饰，强化具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物的对从琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa的反应进行催化的酶的活性的工序；以及增大该微生物的yhhs或其同源物的表达量的工序。
18、(10)一种3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法，包括对增大了有机磷酸化合物排出载体的表达量的具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物进行培养的工序。
19、(11)一种己二酸的制造方法，包括：通过(8)或(10)所述的方法制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的工序a；以及在氢化催化剂的存在下，使3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸与氢反应的工序b即氢化工序。
20、(12)一种聚酰胺的制造方法，包括：通过(11)所述的方法制造己二酸的工序；以及使己二酸和二胺缩聚的工序c。
21、(13)根据(11)所述的聚酰胺的制造方法，其中，所述二胺是含有1,4-丁二胺、1,5-戊二胺或六亚甲基二胺的二胺。
22、发明的效果
23、与未增大有机磷酸化合物排出载体的表达量的亲株微生物相比，本发明的基因修饰微生物能够以高生产率生产3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸。
1.一种基因修饰微生物，其强化了在具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物中对从琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa的反应进行催化的酶的活性，并且增大了有机磷酸化合物排出载体的表达量。
2.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其中，所述有机磷酸化合物排出载体为磷酸丝氨酸排出载体和/或草甘膦排出载体。
3.根据权利要求1或2所述的基因修饰微生物，其中，所述有机磷酸化合物排出载体为yhhs、mdtd、rhtb、mfs40或它们的同源物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因修饰微生物，通过导入对以下(a)～(c)中任一项的多肽进行编码的基因，从而增大了所述有机磷酸化合物排出载体的表达量，
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因修饰微生物，还强化了对将3-氧代己二酰-coa还原而生成3-羟基己二酰-coa的反应和/或从3-羟基己二酰-coa生成3-羟基己二酸的反应进行催化的酶的活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因修饰微生物，还强化了对从3-氧代己二酰-coa生成3-氧代己二酸的反应进行催化的酶的活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的基因修饰微生物，其中，所述微生物为属于大肠杆菌属或沙雷氏菌属的微生物。
8.一种3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法，包括对权利要求1至7中任一项所述的基因修饰微生物进行培养的工序。
9.一种基因修饰微生物的制造方法，包括：利用基因修饰，强化具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物的对从琥珀酰-coa和乙酰-coa向3-氧代己二酰-coa和coa的反应进行催化的酶的活性的工序；以及增大该微生物的yhhs或其同源物的表达量的工序。
10.一种3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的制造方法，包括对增大了有机磷酸化合物排出载体的表达量的具有制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的能力的微生物进行培养的工序。
11.一种己二酸的制造方法，包括：通过权利要求8或10所述的方法制造3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的工序a；以及在氢化催化剂的存在下，使3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸与氢反应的工序b即氢化工序。
12.一种聚酰胺的制造方法，包括：通过权利要求11所述的方法制造己二酸的工序；以及使己二酸和二胺缩聚的工序c。
13.根据权利要求11所述的聚酰胺的制造方法，其中，所述二胺是含有1,4-丁二胺、1,5-戊二胺或六亚甲基二胺的二胺。
