本发明涉及包含非糖基化tnfα免疫缀合物和糖基化tnfα免疫缀合物的制剂，特别是药物制剂，其中所述制剂中所述糖基化tnfα免疫缀合物占总tnfα免疫缀合物的百分比低，优选为10％或更低。所述制剂可用于治疗人患者的癌症，如脑肿瘤。
背景技术：
1、本技术人在wo 2001/062298(通过引用以其整体特此并入)中描述了包含与抗体l19融合的人tnfα(“l19-tnfα”)的免疫缀合物。l19(美国专利号8,097,254)特异性结合纤连蛋白异形体b-fn的ed-b结构域，其为血管生成的最著名标记之一。ed-b是在b-fn异形体中发现的91个氨基酸的额外结构域。ed-b在侵袭性肿瘤和经历血管生成的其他组织(如处于增生期的子宫内膜和处于病理状态下的一些眼部结构)中在新生血管结构周围累积，但是在正常的成年组织中原本是检测不到的。本技术人先前已经在wo 2013/045125、wo2018/011404、wo 2019/185792、wo 2021/234178(通过引用以其整体并入本文)中描述了l19-tnfα的许多用途(包括治疗人癌症)和配制品。
2、免疫缀合物(如l19-tnfα)的大规模生产可以通过重组表达来实现。然而，原核(细菌)表达不适于表达复杂蛋白，如在溶液中形成大的150kda的非共价同三聚体的l19-tnfα。
3、borsi等人blood(2003)102,4384详细描述了使用sp2/0鼠骨髓瘤细胞表达重组l19-鼠(m)tnfα的方法，报告了最终产量为3mg/l的纯化蛋白，这不适合于缀合物的工业生产。
4、鉴于上述情况，本领域需要用于大规模生产适合于治疗人患者的l19-人tnfα的另外的方法。
技术实现思路
1、诸位发明人设计了用于制备l19-tnfα的生产方法，所述方法具有高产率，并且令人惊讶地导致制剂中糖基化l19-tnfα的百分比低。特别地，据报道在所述制剂中所述糖基化l19-tnfα的百分比在3％与5.36％之间(图5a)，平均4.19％的所述l19-tnfα被糖基化(图5b)。
2、此外，预期与包含高百分比糖基化l19-tnfα的制剂相比，包含低百分比糖基化l19-tnfα的制剂具有优异的生物活性。特别地，预期相对于糖基化l19-tnfα缀合物，非糖基化l19-tnfα缀合物对肿瘤坏死因子受体1(tnfr1)和/或肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)具有增加的亲和力。
3、还预期与包含高百分比糖基化l19-tnfα的制剂相比，包含低百分比糖基化l19-tnfα的制剂具有优异的热稳定性和/或储存稳定性。特别地，预期相对于糖基化l19-tnfα缀合物，非糖基化l19-tnfα缀合物具有增加的热稳定性。
4、仍进一步，预期与包含高百分比糖基化l19-tnfα的制剂相比，包含低百分比糖基化l19-tnfα的制剂对蛋白酶介导的降解更不敏感。特别地，预期相对于糖基化l19-tnfα缀合物，非糖基化l19-tnfα缀合物对蛋白酶介导的降解更不敏感。
5、还预期与包含高百分比糖基化l19-tnfα的制剂相比，包含低百分比糖基化l19-tnfα的制剂更适合于冻干。
6、不希望受理论束缚，据信用于制备本文所述的l19-tnfα缀合物的发酵条件导致观察到低水平的糖基化物质。
7、高水平的糖基化在以下方面造成挑战：用于良好操作规范(gmp)生产的批次间再现性、增加的免疫原性和制备用于工业开发的产品时未达最佳标准的药代动力学。durocher和butler,current opinion biotechnol(2009),20,770解释，聚糖结构可能具有免疫原性，并且免疫原性可能因免疫系统的快速清除而降低生物制剂的功效。planinc等人analytica chimica acta(2016)13,27类似地证实了聚糖的低丰度的重要性，这是由于聚糖的潜在免疫原性。leepenies和seeberger nature biotechnol.(2016),32,443进一步评论，异质性糖基化可能在功效或药代动力学方面导致批次间差异。
8、鉴于以上详细描述的与免疫缀合物(如l19-tnfα)的糖基化相关的缺点，预期与包含更高百分比糖基化l19-tnfα的l19-tnfα制剂相比，由诸位发明人设计的生产方法产生的制剂中糖基化l19-tnfα的低百分比在用于人患者的治疗时具有有利的特性。
9、鉴于先前已经示出当在相同细胞系(中国仓鼠卵巢)中制备时人tnfα的生产导致高水平的糖基化的事实，所述制剂中糖基化l19-tnfα的低水平是出人意料的。特别地，在wo98/55662中，重组非缀合人tnfα在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的表达得到如下tnfα制剂，其中据报道总tnfα的35％为o-糖基化的。作者认为这是有利的，因为与非糖基化tnfα相比，糖基化tnfα可以在体液中具有增加的半衰期，可以改善与受体的结合，并且可以针对蛋白酶的影响受到更好的保护。在takakura等人,eur j bioch(1996),235,431中，使用人b细胞类淋巴母细胞细胞系ball-1来表达重组人tnfα。与wo 98/55662中报道的高水平的糖基化相一致，据报道在所得制剂中o-糖基化tnfα的百分比为20％。进一步报道了o-糖基化与人tnfα的氨基酸序列位置4处的丝氨酸连接。
10、因此，在第一方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
11、(i)非糖基化tnfα免疫缀合物；和
12、(ii)糖基化tnfα免疫缀合物；
13、其中所述tnfα免疫缀合物包含与含有seq id no:1至6中所示的l19互补决定区(cdr)的抗体分子缀合的人tnfα，并且
14、其中在所述制剂中所述糖基化tnfα免疫缀合物占总tnfα免疫缀合物的百分比≤10％。
15、在优选的实施方案中，在所述tnfα免疫缀合物中的抗体分子包含seq id no:7中所示的l19 vh结构域和seq id no:9中所示的l19 vl结构域。更优选地，所述抗体分子具有seq id no:10中所示的呈scfv形式的l19抗体的序列。最优选地，所述tnfα免疫缀合物由seq id no:13中所示的l19-tnfα的序列组成或包含seq id no:13中所示的l19-tnfα的序列。
16、所述tnfα优选是人tnfα。最优选地，所述tnfα具有seq id no:11中所示的序列。
17、因此，在优选的实施方案中，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
18、(i)非糖基化l19-tnfα；和
19、(ii)糖基化l19-tnfα；
20、其中所述l19-tnfα包含seq id no:13中所示的序列或由其组成；并且
21、其中在所述制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比≤10％。
22、在所述制剂中所述糖基化tnfα免疫缀合物占总tnfα免疫缀合物的百分比优选≤10％、≤9％、≤8％、≤7％或≤6％，出于以上解释的原因，较低的糖基化％是优选的。
23、在所述制剂中所述糖基化tnfα免疫缀合物占总tnfα免疫缀合物的百分比可以为≥2％或≥3％。
24、例如，在所述制剂中所述糖基化tnfα免疫缀合物占总tnfα免疫缀合物的百分比可以为≥3％并且≤6％。
25、所述糖基化tnfα免疫缀合物优选包含在tnfα的位置4丝氨酸处的o-连接的糖基化，其中所述tnfα具有seq id no:11中所示的序列。在所述tnfα免疫缀合物是l19-tnfα并且包含seq id no:13中所示的序列或由其组成的情况下，所述糖基化l19-tnfα优选包含在seq id no:13的位置257处的丝氨酸上的o-连接的糖基化。所述o-连接的糖基化优选包含一个己糖-乙酰基-己糖1的核心和一个n-乙酰神经氨酸残基。最优选地，所述o-连接的糖基化是hexnac1hex1neuac1。在优选的实施方案中，所述tnfα免疫缀合物在所述tnfα序列中的任何其他位置处均未被糖基化。
26、在优选的实施方案中，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：
27、(i)非糖基化l19-tnfα；和
28、(ii)糖基化l19-tnfα；
29、其中所述l19-tnfα包含seq id no:13中所示的序列或由其组成，其中在所述制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比≤6％，并且
30、其中与制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂具有更高的生物活性。
31、在优选的实施方案中，相对于制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比为15％或更高的制剂，所述制剂对肿瘤坏死因子受体1(tnfr1)和/或肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)具有增加的亲和力。
32、在优选的实施方案中，与制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂具有优异的热稳定性和/或储存稳定性。
33、在优选的实施方案中，与制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂对蛋白酶介导的降解更不敏感。
34、在优选的实施方案中，与制剂中糖基化l19-tnfα占总l19-tnfα的百分比为15％或更高的制剂相比，所述制剂更适合于冻干。
35、用于确定tnfα免疫缀合物的制剂中糖基化tnfα免疫缀合物的类型和百分比的方法是本领域技术人员已知的，并且包括质谱法，特别是完整质量分析，如本文所述。
36、除了活性成分(糖基化和非糖基化tnfα免疫缀合物)外，本发明的药物制剂可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的并且适合于施用至人患者的其他材料。此类材料应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。对于在肿瘤部位注射，所述药物制剂可以呈肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液无热原并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。
37、本发明的药物制剂可以用于在治疗患者的癌症的方法中使用。还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的药物制剂。类似地，提供了本发明的药物制剂在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。所述患者优选是人患者。
38、可以使用本发明的药物制剂治疗的癌症包括皮肤癌(如恶性黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌)、肉瘤(如软组织肉瘤)和脑肿瘤(如神经胶质瘤或胶质母细胞瘤)。
39、本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这样的组合。
1.一种药物制剂，所述药物制剂包含：
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述糖基化l19-tnfα包含在seq id no:13的位置257处的丝氨酸上的o-连接的糖基化。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述o-连接的糖基化由hexnac1hex1neuac1组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述糖基化l19-tnfα的百分比通过质谱法分析来确定，优选通过完整质谱法分析来确定。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂用于在治疗患者的癌症的方法中使用。
7.根据权利要求6所述的用于所述用途的药物制剂，其中所述癌症是黑色素瘤、神经胶质瘤或皮肤癌，如恶性黑色素瘤或非黑色素瘤皮肤癌。
8.根据权利要求6或7所述的用于所述用途的药物制剂，其中所述方法包括向所述患者施用第二抗癌治疗剂。
