本发明涉及一种基于对化合物在哺乳动物蛋白p53的转录激活结构域(tad)存在至少一个磷酸化氨基酸的情况下的结合的检测，来识别改进的抗衰老化合物的方法，特别是体外方法。本发明还涉及一种在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防的方法，特别是体外方法，其基于在得自该受试者的生物样本中检测哺乳动物p53蛋白tad和/或c端区域中氨基酸磷酸化的量和/或在得自该受试者的生物样本中检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体的量和/或与磷酸化p53的共定位。此外，本发明涉及用于实施上述方法的试剂盒及其各用途。最后，提供改进的抗衰化合物或药物组合物。
背景技术：
1、细胞凋亡(程序性细胞死亡)提供对于损伤细胞的杀伤。正在经历凋亡最终阶段的濒死细胞，呈现出吞噬性分子，使得这些细胞被具备合适受体的细胞，例如噬菌体，吞噬。
2、已经示出，衰老细胞随着年龄的增长而在年龄相关的病理位置积聚。此外，衰老细胞可以获得使它们重新进入增殖状态的突变。因而，良性的衰老损伤保留有变为恶性的可能。确实，已经将衰老与很多(年龄相关)病理相关联，反过来，衰老细胞的遗传学清除可以延缓衰老的特征。
3、细胞衰老是在很多情况下引发永久的细胞周期停滞且引起显著的表型变化如生成生物活性分泌蛋白组(又称为衰老相关分泌表型(sasp))的胁迫应答。急性的衰老诱导可对抗癌症，并限制纤维化，但是持续存在的衰老细胞会驱使年龄相关疾病。因而，靶向衰老细胞来延迟衰老并限制功能失调，又称为“衰老疗法”，正蓄势待发。选择性杀伤衰老细胞的药物，又称为“衰老细胞清除剂”，是主要的焦点所在，而以sasp为中心的方法正崛起为靶向衰老相关疾病的又一选择。
4、近来已示出，以遗传学方式清除衰老细胞，在加速衰老的小鼠模型中，可以显著地改善健康度，并降低衰老参数。这些小鼠显示出降低的衰老迹象，如由驼背(过度骨弯曲)、肌肉强度、脂肪堆积和白内障所衡量的那样。这提供了进一步的证据，细胞衰老和sasp与年龄相关表型和癌症有着因果联系(baker et al.,2011.nature 479(7372):232-6)。这个概念验证型的证据是在具有较差治疗应用的遗传学方式下获得的。
5、研究已经一致地揭示出，foxo(叉头盒o)转录因子为衰老和长寿的重要决定因素。foxo蛋白代表了从秀丽隐杆线虫到哺乳动物均保守且作为胰岛素和胰岛素样生长因子信号通路下游的关键长寿调节因子的转录因子亚族。无脊椎动物基因组有一个foxo基因，而哺乳动物有四个foxo基因：foxo1、foxo3、foxo4、和foxo6。在哺乳动物中，该亚族参与大范围的用于调控胁迫耐受、代谢、细胞周期停滞、和细胞凋亡的关键细胞流程。它们在决定长寿中的作用是复杂的，还有待充分阐明。
6、bourgeois和madl(于regulation of cellular senescence via the foxo4-p53axis.febs lett.2018jun；592(12):2083-2097)披露了，在过去的十年，foxo和p53均被识别为衰老的关键因子，且它们的失调与多种疾病包括癌症相关联。然而，据说很多根本的分子机制都还未知，包括foxo和p53对衰老的调控。foxo和p53之间似乎共享一些活性，包括它们在调控细胞衰老中的核心作用。他们聚焦于foxo和p53之间关联性的最新进展，特别聚焦于foxo4-p53轴和foxo4/p53在细胞衰老中的作用。讨论了靶向foxo4-p53相互作用以调节细胞衰老，作为治疗衰老相关疾病和病态的药物靶点的潜在策略。
7、miller jenkins等人(于p53 n-terminal phosphorylation:a defining layerof complex regulation,carcinogenesis,volume 33,issue 8,august 2012,pages1441–1449,https://doi.org/10.1093/carcin/bgs145)揭示了，p53肿瘤抑制因子是细胞应答胁迫的关键组分。由于它可以抑制细胞生长，p53在大多数肿瘤中突变或功能性失活。众多与转录辅助因子的蛋白-蛋白相互作用，对于p53依赖型应答是关键的。在其活化状态时，p53在蛋白的n和c端区域广泛修饰。这些修饰，特别是n端转录激活结构域中丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化，通过调节蛋白-蛋白相互作用的亲和力而影响p53的稳定性和活性。他们对涉及p53 n端磷酸化作用的体外和体内研究的最新发现进行了综述。这些修饰可以积极地或负面地影响p53，并对p53转录激活结构域的各种相互作用添加第二层复杂调控。
8、feng等人(于ser46 phosphorylation regulates p53-dependent apoptosisand replicative senescence.cell cycle.2006dec；5(23):2812-9.doi:10.4161/cc.5.23.3526.epub 2006dec 1.pmid:17172844)揭示了，细胞系研究已经示出，ser46的磷酸化与p53细胞凋亡活性的激活相关。
9、baar mp等人(于targeted apoptosis of senescent cells restores tissuehomeostasis in response to chemotoxicity and aging.cell.2017mar 23；169(1):132-147.e16.doi:10.1016/j.cell.2017.02.031.pmid:28340339；pmcid:pmc5556182)揭示了扰乱foxo4与p53相互作用的foxo4肽。在衰老细胞中，其选择性地造成p53细胞核排斥和细胞内在凋亡。这个肽在衰老细胞中、或在相对于对照细胞呈现出foxo4表达增加且表达ser15磷酸化p53的细胞中，展现出细胞凋亡诱导活性。
10、wo 2019/069070 a1公开了衰老清除人工肽，当其间歇地施用时，可选择性地杀伤哺乳动物中衰老细胞。foxo4表达被扰乱的dna损伤型黑色素瘤细胞，会引起细胞凋亡的显著增加。这些发现指出，foxo4的存在，通过s46磷酸化的p53而抑制细胞凋亡。此外，已经示出，对可磷酸化p53的s46的激酶进行抑制，即便不存在foxo4时，也引起受损的衰老细胞凋亡。因而，提出了foxo4在抑制由s46磷酸化p53介导的细胞凋亡中的关键作用。
11、wo 2016/118014涉及一种含有氨基酸序列ltlrkepaseiaqsileaysqngwanrrsggkrp(seq id no:7)的肽，其中在该氨基酸序列中的氨基酸是d-氨基酸残基，并且涉及在治疗年龄相关疾病中使用该肽的方法。该肽在衰老细胞、或foxo4表达相对于对照细胞增加且表达ser15磷酸化p53(pser15-p53)的细胞中展现出细胞凋亡诱导活性。
12、wo 2013/152038涉及可抑制jun激酶和/或foxo4的药剂在个体中治疗癌症和/或除去衰老细胞的用途。在一些实施方式中，该药剂是小分子，例如sp600125。在一些实施方式中，该药剂是小分子，例如as601245。在一些实施方式中，该药剂是所公开的肽。
13、wo 2013/152041涉及一种抑制foxo4功能的药剂及其在个体中治疗癌症和/或除去衰老细胞的用途。在一些实施方式中，抑制foxo4的药剂是抑制细胞中foxo4功能的肽，其中该肽包含所公开的包含与foxo4片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。
14、wo 2018/129007涉及靶向衰老细胞的条件性激活蛋白，以及制备该条件性激活蛋白的方法。
15、wo 2021/165538涉及用于治疗受益于衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞清除的疾病或病症，例如癌症，的改进化合物。wo 2021/165538还涉及用于治疗罹患、或疑似罹患受益于衰老细胞、瘢痕(scarred)细胞、和/或癌细胞清除的疾病或病症的个体的方法。
16、从上述可以清楚地看出，在领域内仍需要改进的检定和方法，来识别出可使用选择性诱导衰老细胞中细胞凋亡的化合物的有效疾病治疗。细胞衰老特别地与退行性(功能缺失)疾病和癌症(功能获得)相关，其均涉及哺乳动物蛋白p53。因而，本发明的目的，是提供对可使用选择性诱导衰老细胞中凋亡的化合物的有效疾病治疗进行识别的检测和方法。
技术实现思路
1、在其第一个方面，本发明通过提供一种用于识别改进的抗衰老化合物而解决上述问题，其包括以下步骤：a)使至少一种抗衰老候选分子与哺乳动物p53蛋白的转录激活结构域(tad)接触，b)在tad中存在至少一个磷酸化氨基酸的情况下，检测候选分子与tad的特异性结合，以及c)将该特异性结合与tad不存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合进行比较，其中在tad存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合的增强，识别出改进的抗衰老化合物。在其最优选的实施方式中，使用本发明的方法，以识别出改进的得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转(retro-inverso)肽、含有该得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选地为选自cl04183、cl04124和cl04177(参见以下)或其核心序列的肽。
2、优选的是根据本发明的方法，其中该tad1的磷酸化，位于人p53的ser15和/或ser20，和/或该tad2的磷酸化，位于人p53的ser46和/或thr55，或其他p53 tad中的类似位置。优选地，tad2的磷酸化位于人p53的thr55，或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。在根据本发明方法的其他优选实施方式中，结合的检测还包括，当可行的时候，检测人p53c端区域中ser392或其他哺乳动物p53蛋白中类似位置的磷酸化，以及将该特异性结合与不存在该磷酸化氨基酸时的进行比较。
3、在其第二个方面，本发明通过提供根据本发明方法识别的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物，而解决上述问题。
4、在其第三个方面，本发明通过提供一种在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防的方法而解决上述问题，其包括a)向该受试者提供抗衰老治疗或预防，包括向该受试者施用与p53蛋白tad特异性结合的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据本发明的化合物或药物组合物，b)在得自该受试者的生物样本中检测p53蛋白tad中氨基酸的磷酸化的量，和/或检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体的量，和/或在得自该受试者的生物样本中检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体与磷酸化p53蛋白的共定位，以及c)将在步骤b)中检测的量和/或共定位与早前从该受试者取得的样本和/或对照样本中的量和/或共定位进行比较。
5、在其第四个方面，本发明通过提供一种用于对哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后的方法，包括实施根据本发明的方法，其中磷酸化和/或pml蛋白和/或磷酸化p53与pml的共定位的增加，指示哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性。
6、在其第五个方面，本发明通过提供特异性结合p53蛋白tad的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据本发明的化合物或药物组合物，在衰老细胞的预防或治疗中的用途而解决上述问题，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad中类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白的量的增加。
7、优选的是根据本发明的抗衰老化合物或药物组合物的用途，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，还展现出人p53 c-端区域ser392、或其他哺乳动物p53蛋白中类似位置的磷酸化的量的增加。另外优选的是根据本发明的抗衰老化合物或药物组合物的用途，其中该衰老细胞选自原发性肿瘤细胞、转移性肿瘤细胞、次发性肿瘤的细胞、微转移和/或大转移的细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
8、在其第六个方面，本发明通过提供一种在受试者中预防或治疗衰老细胞的方法而解决上述问题，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad中类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白的量的增加，方法包括向受试者施用有效量的与p53蛋白tad特异性结合的抗衰老化合物或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据本发明的化合物或药物组合物。
9、优选的是根据本发明的方法，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，还展现出人p53 c端区域ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。此外优选的是方法，其中该衰老细胞选自原发性肿瘤细胞、转移性肿瘤细胞、次发性肿瘤的细胞、微转移的细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
10、本发明基于发明人的出乎意料的发现，即，p53蛋白的磷酸化，是抗衰老分子有效结合p53的tad和/或c端区域的重要因素。tad1和2包含四个可以因磷酸化而电荷变化的氨基酸残基。本文公开的foxo4-fh衍生结合物，与tad2特异性相互作用，这表明s46和t55对于结合和选择性较为重要。根据本发明识别的foxo4-fh衍生结合物，例如cl04183，相比非磷酸化的，对ser46/thr55磷酸化的结合更紧(参见图16)。还发现ser392是相关的(参见以下)。
11、在上述背景下，当前发明分析了某些抗衰老化合物，例如得自哺乳动物特别是人的叉头盒蛋白o4(foxo4)的逆序翻转肽(其中氨基酸序列中的氨基酸为d-氨基酸残基)，对p53蛋白的结合效率。优选的实例是包含以下氨基酸序列的化合物：rkkasskieaaildafsqnwrffkrpprrrqrrkkrg(seq id no:1；称为cl04124)；rkkasskieaeildafsqnwrrkrpprrrqrrkkrg(seq id no:2；称为cl04177)；和akieaaildafsqnwrkrrrrqrrkkrg(seq id no:3；称为cl04183)。
12、还发现，独立于以上，抗衰老分子的结合，还强烈地受到p53蛋白s392位磷酸化的影响，且发现，s392磷酸化造成p53采用“开口”构型，所测试的某些优选抗衰老分子，例如分子cl04183，在对抗含ps392的和/或“开口”-p53时特别有效(例如，参见图14)。
13、早幼粒白血病蛋白(pml)(又称为myl、rnf71、pp8675或trim19)是pml基因的蛋白产物。pml蛋白是装配多个细胞核结构(称为pml-核体或pml(蛋白)体，在细胞核的染色质中形成)所需的肿瘤抑制因子蛋白。这些核体存在于哺乳动物细胞核中，每个细胞核约1-30个。已知pml-(n)b具有多个细胞调节功能，包括参与程序性细胞死亡、基因组稳定性、抗病毒效应和控制细胞分裂。已知pml突变或丧失，以及之后这些程序的失调，与多种癌症相关。
14、除上述以外，在本发明的背景下，还令人意外地发现，pml体可用作所测试的某些优选抗衰老分子(例如分子cl04183)效力的“代表p53生物标记物”。发现cl04183在对抗具有ps392/“开口”-p53和pml提升和/或磷酸化p53与pml共定位的细胞时特别有效(参见，例如图12)，特别是对抗肝和肺中的pml高转移。这很可能是因为肿瘤转移需要起始的类干细胞，而pml与“干细胞性”状态特别是cd44和活性β-连环蛋白相关这一事实。
15、diana putavet等人(于repurposing the foxo4 senolytic against triple-negative breast cancer[abstract].in:proceedings of the 2021san antonio breastcancer symposium；2021dec7-10；san antonio,tx.philadelphia(pa):aacr；cancer res2022；82(4suppl):abstract nr p1-19-02)揭示了，三阴性乳腺癌(tnbc)的预后特别差，部分地是由这些肿瘤缺乏相关分子靶标引起的。tnbc中最常突变的基因是肿瘤抑制因子p53。他们发现，在tnbc中，突变的p53具有独特的构型，其经由与隐蔽在早幼粒白血病(pml)基聚集体中的转录因子叉头盒o(foxo)4结合，而具有新的致癌作用。由于这些细胞核结构是衰老细胞特定的，我们测试了清除衰老细胞的foxo4肽。在细胞毒性实验中，我们发现，这个化合物，相比于其他乳癌亚型，更特异地靶向tnbc。最重要的是，这些化合物在最常用于人乳癌转移的小鼠模型中，降低癌转移负担。他们表明，由突变p53驱动的癌，呈现出衰老细胞特定的特征，使得它们成为foxo4导向的抗衰老疗法的较好候选物。对衰老细胞清除剂的创造性用途调整，可以转化至由突变p53驱动的其他癌类型。没有提及p53的磷酸化。
16、在本发明的背景下，术语“tp53”或“p53”将指代哺乳动物蛋白p53，特别是人tp53、小鼠trp53、大鼠tp53，猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗或猫tp53的基因。还包括与foxo4蛋白或其片段结合的p53的所有天然变体和功能片段，特别是反式激活结构域(tad)或转录激活结构域。人p53的氨基酸序列可在p04637找到。
17、在本发明的背景下，术语“tad”将涉及处于上述p53蛋白n端的两个不同反式激活结构域中的一个。raj和attardi(于the transactivation domains of the p53protein.cold spring harb perspect med.2017；7(1):a026047.published 2017jan3.doi:10.1101/cshperspect.a026047)公开了p53的tad的结构和功能(特别参见图1)。还公开了p53 tad(约1-85/92位)中作为磷酸化靶点且影响p53 tad与结合伴侣相互作用的丝氨酸和苏氨酸。当包括该区域的现在认为是脯氨酸富集结合域(prd)的羧基端时，人tad1是约氨基酸1-40/42，且tad2是约氨基酸41/43-63或92，参见图1。
18、因而，如上所述，在其第一个方面，本发明通过提供一种用于识别改进的抗衰老化合物的方法，特别实体外方法，而解决上述问题，其包括以下步骤：a)使至少一种抗衰老候选分子与哺乳动物p53蛋白的转录激活结构域(tad)接触，b)在tad中存在至少一个磷酸化氨基酸的情况下，检测候选分子与tad的特异性结合，以及c)将该特异性结合与tad不存在该至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合进行比较，其中在tad存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合的增强，识别出改进的抗衰老化合物。在其最优选的实施方式中，使用本发明的方法，以识别出改进的得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、含有该得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选地为选自cl04183、cl04124和cl04177(参见以下)或其核心序列的肽。
19、图3示出结合检测的结果，显示foxo4(a)和foxo4衍生(例如，模拟)肽(b)和(c)以明显更高的亲和力与t55或s46磷酸化时的p53-tad2结合。图4示出foxo4衍生肽cl04183可以与细胞中处于野生型或t55或s46磷酸化模拟的全长p53结合，但是不在这些位点无法磷酸化时结合。图11示出，在化疗中存活的癌细胞显示出增加的pml体和磷酸化p53。这些细胞对于cl04183处理更加敏感，参见图13。
20、优选的是根据本发明的方法，其中该接触为体内或体外，在溶液中，或包含与固相载体结合或偶联的哺乳动物p53蛋白tad或抗衰老候选化合物。各个形式也在领域中有所记载，且为本领域技术人员所知。
21、优选的是根据本发明的方法，其中该tad1的磷酸化，位于人p53的ser15和/或ser20，和/或该tad2的磷酸化，位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。优选地，该tad2的磷酸化，位于人p53的thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。在根据本发明的方法的另一优选实施方式中，对结合的检测还包括，当可行的时候，检测人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化，且包括将该特异性结合与不存在该磷酸化氨基酸时进行比较。
22、在本发明的背景下，可以使用任何合适的哺乳动物tad。优选的是根据本发明的方法，其中哺乳动物p53蛋白的tad选自人、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗、和猫p53蛋白的tad1和/或tad2，任选地为全长p53蛋白的一部分，特别是重组p53蛋白，含有人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的全长p53蛋白，包含该tad1和/或tad2、或tad1或tad2的磷酸化片段的重组融合蛋白，及其突变体。优选地，该tad1结构域的磷酸化，位于人p53的ser15和/或ser20，和/或该tad2的磷酸化，位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
23、在本发明的背景下，抗衰老候选分子可以选自适合于结合哺乳动物p53的任何合适的分子，例如有机化学分子、选自有机小分子库(分子量低于500da)的分子、选自组合库的分子、细胞提取物(特别是植物细胞提取物)、小分子药物、蛋白、蛋白片段、选自肽库的分子、抗体或其片段。特别优选的是得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177的肽，如上所解释的。其他肽在wo 2021/165538中有公开(出于此目的，通过引用的方式并入本文)。这些候选分子用作筛选改进化合物的基础，其中某些氨基酸被修饰(参见以下)。
24、如果抗衰老候选分子是肽，该化合物还可以包含赋予细胞穿透特性、细胞器靶向特性、细胞核定位、线粒体定位、血脑屏障渗透性、细胞膜定位、和/或肽酶切割的序列，例如，比如hiv的tat序列(grkkrrqrrrpp，seq id no:8)、或arkkrrqrrrppp(seq id no:9)。如果抗衰老候选分子是肽，该化合物还可以包含非天然存在的氨基酸，优选地与该化合物该位置的天然氨基酸具有相同或基本相同的所需特性，修饰的氨基酸，例如，比如接头氨基酸、订合物、半胱氨酸键、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇化位点。
25、在本发明的背景下，可以使用任何适合于检测化合物结合的方法。各个方法为本领域技术人员所知，且在领域内公开。优选的是根据本发明的方法，其中对该结合的检测包括检测磷酸化，包括放射性标记32p正磷酸盐、磷酸化特异性抗体、和/或质谱。
26、本文公开的检测的组分可以，例如用放射性标记物或荧光标记物或抗原标记物，进行标记。
27、在本发明的另一个方面，对结合的检测包括，化合物，特别是肽，例如cl04177、cl04124或cl04183，与蛋白foxo4或其tad结合肽的竞争性结合，即，对于该修饰化合物在存在该至少一种化合物时(与不存在该化合物相比)的检测，与不存在该化合物、以及其不同磷酸化状态时进行比较。
28、对于结合的检测还可以包括，当可行的时候，检测人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化，以及将该特异性结合与不存在该磷酸化氨基酸时的进行比较。再次地，这可以使用合适的选择性抗体进行。
29、本发明的另一个方面涉及一种用于识别与p53的tad或其foxo4结合片段结合、或与p53结合并抑制细胞中foxo4与p53相互作用的改进化合物，包括以下步骤：a)提供至少一种抗衰老候选化合物；b)适当地修饰a)的化合物；c)使b)的至少一种抗衰老候选分子与哺乳动物p53蛋白的转录激活结构域(tad)接触；d)检测该候选分子与tad在tad存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的特异性结合；以及e)将该特异性结合与tad中不存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合进行比较，其中在tad存在至少一个磷酸化氨基酸情况下的结合的增强，识别出改进的抗衰老化合物。
30、优选的是根据本发明的方法，其还包括，对所识别的化合物检测其诱导细胞凋亡和/或杀伤衰老、瘢痕和/或肿瘤细胞的活性，优选地包括确定升高的半胱天冬酶-3/7活性、线粒体细胞色素c的缺失、tunel阳性、胞外膜联蛋白v阳性、和/或细胞死亡标记物升高(例如细胞碘化丙啶的包含、乳酸脱氢酶释放检测、和/或活力丧失，如钙黄绿素-am整合的丢失或mts活力检定)。
31、另外优选的是根据本发明的方法，其中该tad或其foxo4结合片段在细胞中重组表达。
32、本发明还涉及设计的改进的抑制性化合物，因为foxo1/3/6和foxo4之间的进化演变差异表明，一些氨基酸可以改变或修饰，以创建出改进的抑制性化合物。所有这些修饰呈现为新的策略，其中这些或其组合物中的任何一个，最终引起用在本发明背景中的改进分子的“合理设计”。本发明还包括进一步改善仅部分地经历“定向进化”或“定向诱变”的化合物的策略。
33、在本发明背景下使用的改进化合物的“合理设计”过程中，为了进一步改善仅部分地经历“定向进化”或“定向诱变”的化合物，化合物可以进行多轮连续的上述方法。
34、在提供化合物(例如，肽)之后，例如在其适当的化学合成之后，该化合物可以进行修饰。通常而言，很多如何修饰本发明化合物的方法，为领域内技术人员所知，且在文献中有所记载。化合物的修饰，通常将落入多个类别，例如a)氨基酸突变/变化成不同氨基酸，b)氨基酸的化学修饰，例如经由添加另外的化学基团，c)氨基酸结构(例如，l-到d-型)或连接键(例如，逆序翻转连接键的引入)的修饰，d)化合物长度的改变，和e)向分子附上另外的基团(包括标记物基团、标记物、接头或载体，例如螯合剂)。
35、如上所述，foxo1/3/6与foxo4之间的进化演变差异表明，一些氨基酸仍可进行修改，以创建出显示所需结合以及-最终地-抑制活性的改进化合物。foxo4-fh片段和p53-tad2结构域的分析显示，p53中的负电荷介导与foxo4、以及疏水性tyr的结合。因而，根据本发明的肽的氨基酸，可以突变成有益于相互作用强度的正电荷氨基酸。实例是赖氨酸(k)、精氨酸(r)、和组氨酸(h)。nmr实验还示出，p53中的负电荷氨基酸，负责在sq基序(位点)周边与foxo4相互作用。该位点可以变为磷酸化的，为防止这个情况的发生，该位点可变突变成小核苷酸，如丙氨酸(a)、甘氨酸(g)或丝氨酸(s)。用于引入这些突变的方法为技术人员所知，且包括在肽的化学合成过程中引入变化，或肽编码核苷酸序列经由例如基于核苷酸的突变、包含pcr的突变等相应改变的遗传学方法。同时，随机突变是可行的。
36、此外，氨基酸可以经化学修饰而改变，例如经由在合成过程中添加另外的化学基团，或经由翻译后或合成后修改。修饰氨基酸的方法，为现有技术熟知，且在例如christopher d.spicer&benjamin g.davis.selective chemical protein modificationnature communications volume 5,article no.:4740(2014)或sakamoto s,hamachii.recent progress in chemical modification of proteins中有总结。同时，可以进行氨基酸结构(例如，l-到d-型)或氨基酸间连接(例如，在合成过程中引入逆序翻转连接)的修饰。
37、最后，可以对分子引入另外的化学和/或功能基团，例如，比如标志物基团、标记物、接头氨基酸、订合物、半胱氨酸桥、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇位点、接头或载体，如螯合剂。
38、在下一步骤中，对修饰的化合物测试至少一种化合物与p53的tad在其不同磷酸化状态下的至少一种结合。如本文所讨论的，化合物与tad及其磷酸化状态结合的特性，对于化合物的所有用途都是必须的，不管它们用于治疗或诊断。在本发明的背景下，“改进”的结合包括，修饰化合物与未修饰(即，起始)化合物以相同程度结合，尽管化合物已经被修饰(例如，二聚化或通过添加标志物或其他基团)的场景。优选的是，修饰成展现对于靶标，即p53的tad，在其磷酸化状态下的更强的结合。还优选的是，例如由于该修饰化合物在体外或体内改进的稳定性，而示出对于靶标，即tad或其结合片段的更持久结合的化合物。
39、检测化合物与靶标(即tad)结合的测试为技术人员熟知，且优选地包括质谱、nmr检测、拉下(pull-down)检测等。
40、如上所述，化合物与tad及其磷酸化状态结合的特性，对于化合物的所有用途都是必须的，不管它们用于治疗或诊断。理想地是，该结合也对意向的靶标，即tad特异，或者至少相当地或基本上特异。这将在化合物的医疗使用中减少或避免任何不想要的副作用，并在诊断使用中减少或避免任何背景或假阳性结果。
41、在方法的最后一个步骤中，在本发明的优选方面，基于与在方法开始时所提供化合物相比，识别出取决于磷酸化状态而与p53的tad，特别是p53的tad2结合，优选地取决于磷酸化的状态而与tad结合并抑制细胞中foxo4与p53相互作用的改进化合物。认为该功能对于本发明化合物的通过消除衰老细胞的治疗性功能是必须的，根据本发明的改进的诊断性分子可能不是强制地需要这些特性/功能。
42、对这些改进化合物的识别，可以包括检测这些化合物例如foxo4-肽的效力，以更好地结合磷酸化tad并消除衰老细胞，并任选地识别出决定该特性的结构要求；和/或检测这些化合物，例如foxo4衍生肽，的选择性，以消除衰老细胞，并且再次地，任选地识别出决定该特性的结构要求。
43、优选地，改进的化合物，例如根据本发明的肽或改进肽，如果其杀伤、清除、移除或降低衰老细胞培养物中至少5、10、15、20、30、40、50、60、70、或80％细胞的活力，则认为在衰老细胞中展现出细胞凋亡诱导活性。优选地，根据本发明的肽，选择性地在衰老细胞中(即不在非衰老细胞中)展现出细胞凋亡诱导活性。根据本发明的肽，相比于非衰老细胞中的细胞凋亡，以1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5或更高的因子偏好于衰老细胞中的细胞凋亡。
44、根据本发明的肽化合物，优选是分离的。根据本发明的肽化合物，优选地使用合适的肽合成而产生。
45、本发明的另一个方面涉及由根据本发明的方法所识别出的改进的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物以及药学上可接受载体的药物组合物。
46、所用的药物组合物，可以任选地包含，药学上可接受的载体。药学上可接受的载体或赋形剂包括稀释剂(填料、膨胀剂，例如乳糖、微晶纤维素)、崩解剂(例如，羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠)、粘合剂(例如，pvp、hpmc)、润滑剂(例如，硬脂酸镁)、助流剂(例如，胶态sio2)、溶剂/助溶剂(例如，水性载体、丙二醇、甘油)、缓冲剂(例如，柠檬酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐)、防腐剂(例如，苯甲酸钠、对羟基苯甲酸(me、pr和bu)酯、bkc)、抗氧化剂(例如，bht、bha、抗坏血酸)、润湿剂(例如，聚山梨酸酯、山梨糖醇酯)、增稠剂(例如，甲基纤维素或羟乙基纤维素)、甜味剂(例如，山梨糖醇、糖精、阿斯巴甜、安赛蜜)、矫味剂(例如，薄荷、柠檬油、奶油硬糖)、保湿剂(例如，丙二醇、甘油、山梨糖醇)。其他合适的药学上可接受的赋形剂，尤其在remington's pharmaceutical sciences,15th ed.,mack publishingco.,newjersey(1991)以及bauer et al.,pharmazeutische technologic,5th ed.,govi-verlagfrankfurt(1997)中有记载。本领域技术人员知晓合适的肽配方，将能够基于例如药物组合物的配方和施用途径而方便地选择合适的药学上可接受的载体或赋形剂。
47、药物组合物可以经口施用，例如以丸剂、片剂、包衣片、糖衣片、硬的和软的明胶胶囊、液剂、糖浆剂、乳化剂或混悬剂或作为气溶胶混合物的形式。然而，也可以以例如栓剂的形式经直肠，或例如以注射剂或输注剂经肠道外，或以例如软膏剂、乳霜剂或酊剂的形式经皮进行施用。
48、除上述本发明的化合物外，药物组合物可以包含其他惯用的，通常惰性的载体材料或赋形剂。因而，药物制品也可以包含添加剂，例如，比如填料、延展剂、崩解剂、粘合剂、助流剂、甜味剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、矫味或芳香剂、缓冲物质，以及此外的溶剂或增溶剂或用于实现储藏效果的试剂，以及用于改变渗透压的盐，包衣剂或抗氧化剂。它们也可以包含上述本发明两种以上化合物的盐，以及本文所述的其他治疗上有效的物质。
49、本发明的另一方面涉及一种在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防的方法，例如诊断方法，其包括a)向该受试者提供抗衰老治疗或预防，包括向该受试者施用与p53蛋白tad特异性结合的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为本文所述的根据本发明的化合物或药物组合物，b)在得自该受试者的生物样本中检测p53蛋白tad中氨基酸的磷酸化的量，和/或检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体的量，和/或检测在得自该受试者的生物样本中检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体与磷酸化p53蛋白的共定位，以及c)将在步骤b)中检测的量和/或共定位与早前从该受试者取得的样本和/或对照样本中的量和/或共定位进行比较。优选的是磷酸化和/或pml体的量和/或磷酸化p53与pml的共定位的增强，指示出哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性。该方法还可以包括，基于该监控来调整该哺乳动物患者中的治疗或预防。主治医师将能够方便地做出并应用各治疗决定，如果需要的话，也将其他患者参数考虑在内。
50、类似地，本发明的另一个方面涉及一种对哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后的方法，例如诊断方法，包括实施本文所述的根据本发明的方法，其中磷酸化和/或pml体和/或磷酸化p53与pml的共定位的增强，指示哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性。如本文所述，当前发明人令人意外地发现，p53的tad的磷酸化、和/或pml体的量和/或磷酸化p53与pml的共定位，与抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性直接相关。
51、优选的是根据本发明的方法，其中该哺乳动物受试者是人、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗、或猫。
52、优选的是根据本发明的方法，其中哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防包括，施用有效量的本文所识别的化合物、所述的药物组合物、得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合蛋白、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177及其tad2结合衍生物或片段的肽。
53、如本文所述，以有效剂量向受试者施用化合物。该剂量可以在较宽的界限中变动，并在各个体情况中适合于个体情况。对于上述用途，合适的剂量将基于施用方式、将要治疗的特定病症、以及所需的效果而变化。然而，通常而言，如上所述的剂量率达到令人满意的结果，例如约1-100mg/kg动物体重，特别是1-50mg/kg。对于大型哺乳动物例如人的合适剂量率是约10mg-3g/天的量级，通常方便地使用单次，或以分开的剂量，例如一天2-4次，或以缓释的形式。通常而言，在经口施用的情况下，每个人个体约10mg-100mg，特别是10-50mg的日剂量是合适的。在细胞水平达到的有效浓度可以设置在约0.05-200μm，优选地约0.01-100μm，更优选约0.05-10μm。特别优选的是局部施用，例如经吸入而入气道。在这些情况下，剂量可以方便地减少至0.1-10mg/每次给药，优选每次给药0.2-5mg，对于70kg受试者，其等于约3-约80μg每千克。
54、优选的是根据本发明的方法，其中该tad2的磷酸化，位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置，正如本文进一步解释的。优选地，tad2的磷酸化，位于人p53的thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。在本发明的这个方面中，另外优选的是根据本发明的方法，还包括检测人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量，并且将该量与早前从该受试者取得的样本、和/或对照样本中的量进行比较，其中磷酸化的增加还指示出，抗衰老治疗或预防在哺乳动物受试者中的成功和/或进展。
55、优选的是根据本发明的方法，其中得自该受试者的生物样本包含衰老细胞、肿瘤细胞、转移癌细胞、微转移和/或大转移的细胞、和/或纤维化细胞，特别是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺炎、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
56、还优选的是根据本发明的方法，其中该受试者还接受抗衰老细胞化疗，例如抗癌化疗。
57、本发明的另一个方面涉及改进特异性地结合哺乳动物p53蛋白的tad，优选tad2的抗衰老化合物，或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据本发明的用于衰老细胞预防或治疗的化合物或药物组合物，在预防或治疗衰老细胞中的用途，其中该衰老细胞，当与对照细胞相比时，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白的量的增加。优选地，tad2的磷酸化位于人p53的thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
58、也在本发明的该方面内，还优选的是根据本发明用途的改进的抗衰老化合物或药物组合物，其中衰老细胞，当与对照细胞或对照值相比时，还展现出人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。
59、优选的是根据本发明用途的改进的抗衰老化合物或药物组合物，其中得自该受试者的生物样本包含衰老细胞、肿瘤细胞、转移癌细胞、微转移的细胞、和/或纤维化细胞，特别是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺炎、和/或肝癌细胞或其转移细胞。结果，优选的是根据本发明用途的改进的抗衰老化合物或药物组合物，其中该衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移的细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞)、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
60、还优选的是根据本发明用途的改进的抗衰老化合物或药物组合物，其中该受试者还接受抗衰老细胞化疗，例如抗癌化疗。
61、本发明的另一个方面涉及用于在受试者中预防或治疗衰老细胞的方法，其中该衰老细胞，当与对照细胞相比时，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白的量的增加，包括向受试者施用有效量的与p53蛋白的tad特异性结合的抗衰老化合物或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选根据本发明的化合物或药物组合物。优选地，tad2的磷酸化位于人p53的thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
62、也在本发明的该方面内，还优选的是根据本发明的方法，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，还现出人p53的ser392、或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。
63、优选的是根据本发明的方法，其中该衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞)、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺炎、和/或肝癌细胞或其转移细胞。结果，优选的是根据本发明的方法，其中衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞(例如三阴性乳腺癌细胞)、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺炎、和/或肝癌细胞或其转移细胞。还优选的是根据本发明的方法，其中受试者还接受抗衰老细胞化疗，例如抗癌化疗。
64、在本发明的医疗用途方面，(该用途)化合物可以作为合适的药物组合物而提供和/或施用，例如片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、粉剂、囊剂、重构粉剂、干粉吸入剂、吸入剂、和/或咀嚼剂。这类的固体剂型可以包含合适量的赋形剂和其他成分。这些固体剂型可以包含，例如纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(特别是fb聚乙烯吡咯烷酮)、硬脂酸镁等。然而，施用也可以例如以栓剂的形式经直肠，例如以注射剂或输注剂的形式经肠道外，或例如以软膏剂、霜剂或酊剂的形式经皮进行。优选使用干粉吸入剂或其他吸入形式进行施用。
65、将要理解的是，当前的化合物和/或包含当前化合物的药物组合物，用于施用至人患者。术语“施用”是指施用单独的治疗剂或与另一治疗剂组合。因而，设想在联合疗法中采用本发明的药物组合物，即，与其他药剂或药物和/或任何其他在本发明方法背景下可能有益的治疗剂共同施用。然而，其他药剂或药物和/或任何其他治疗剂，如果需要的话，可以与使用的化合物分开施用，只要它们与当前用途化合物共同作用(即，直接地或间接地，优选协同地)。
66、因而，本发明的化合物，可以单独使用，或与其他有效成分(例如与已知用于治疗上述疾病的药剂)组合使用，其中在后一种情况下，注意到有利的附加、扩大、优选协同效应。合适的施用至人的量为1-500mg，特别是5mg-100mg，例如1-10mg/kg/天口服剂量。细胞水平达到的有效浓度可以设置在0.005-200μm，如上面指出的，优选为约0.5-10μm。特别优选的是局部施用，例如经吸入到达气道。在这些情况下，剂量可以方便地减少到0.1-10mg/每次给药，优选0.2-5mg每次给药，对于70kg受试者，其等于约3-约80μg每千克。
67、本发明的另一个方面涉及诊断试剂盒，其包含在一个或分开容器中的任选地与用于实施该方法的辅助剂和/或说明书一起的用于实施本发明方法的材料。
68、优选的是根据本发明的诊断试剂盒，其包含抗衰老候选分子、重组表达的哺乳动物p53蛋白的tad，特别是包含tad1或tad2的n端片段中的至少一种，优选与固相载体结合或偶联。
69、试剂盒还可以包含用于实施上述方法的foxo4或其tad结合部分、与试剂盒中组分结合的相关抗体、放射性标记的32p-正磷酸盐、磷酸化特异性的和/或p53构型特异性的抗体(即，特异于“开口”型)、染料和其他标记物，以及缓冲剂和基质。
70、试剂盒可以用在本发明的方法中，即，用于识别抗衰老化合物，用于在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防，和/或用于对抗衰老治疗或预防在哺乳动物受试者中的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后。
71、本发明涉及以下项。
72、项1.一种用于识别改进的抗衰老化合物的方法，包括以下步骤：a)使至少一种抗衰老候选分子与哺乳动物p53蛋白反式激活结构域(tad)接触，b)检测候选分子与tad在tad中存在至少一个磷酸化氨基酸时的特异性结合，以及c)将该特异性结合与tad中不存在至少一个磷酸化氨基酸时的结合进行比较，其中在tad中存在至少一个磷酸化氨基酸时结合的增强，识别出改进的抗衰老化合物。
73、项2.根据项1的方法，其中该接触是体内或体外的，在溶液中或包含与固相载体结合或偶联的哺乳动物p53蛋白tad或抗衰老候选分子。
74、项3.根据项1或2的方法，其中该抗衰老候选分子选自化学分子、选自有机小分子库的分子、选择组合库的分子、细胞提取物特别是植物细胞提取物、小分子药物、蛋白、蛋白片段、选自肽库的分子、抗体或其片段，特别是得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177的肽。
75、项4.根据项1-3中任一项的方法，其中对该结合的检测包括检测磷酸化，包括放射性标记的32p正磷酸盐、磷酸化特异性抗体、和/或质谱。
76、项5.根据项1-4中任一项的方法，其中哺乳动物p53蛋白的tad选自人、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗和猫p53蛋白的tad1和/或tad2，任选地作为全长p53蛋白的一部分，特别是重组p53蛋白，含有人p53 ser392或其他哺乳动物p53蛋白类似位置的磷酸化的全长p53蛋白，包含该tad1和/或tad2、或该tad1或tad2的磷酸化片段的重组融合蛋白，及其突变体。
77、项6.根据项1-5中任一项的方法，其中该tad1结构域的磷酸化位于人p53的ser15和/或ser20，和/或该tad2的磷酸化位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53tad的类似位置，优选地，该tad2的磷酸化位于人p53的thr55或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
78、项7.根据项1-6中任一项的方法，其中对该结合的检测包括，与蛋白foxo4或其tad结合片段的竞争性结合。
79、项8.根据项1-7中任一项的方法，其中对该结合的检测还包括，当可行的时候，检测人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白类似位置的磷酸化，以及将该特异性结合与不存在该磷酸化氨基酸时进行比较。
80、项9.一种抗衰老化合物，由根据项1-8中任一项的方法所识别，或包含该抗衰老化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
81、项10.一种用于在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防的方法，其包括a)向该受试者提供抗衰老治疗或预防，包括向该受试者施用与p53蛋白的tad特异性结合的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据项9的化合物或药物组合物，b)在得自该受试者的生物样本中检测p53蛋白tad中氨基酸的磷酸化的量，和/或检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体的量，和/或在得自该受试者的生物样本中检测早幼粒细胞白血病蛋白(pml)体与处于其磷酸化形式的磷酸化p53蛋白的共定位，以及c)将在步骤b)中检测的量和/或共定位与早前从该受试者取得的样本和/或对照样本中的量和/或共定位进行比较。
82、项11.一种用于对哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后的方法，包括实施根据项10的方法，其中磷酸化和/或pml蛋白体的量和/或与处于其磷酸化形式的磷酸化p53的共定位的增加，指示哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性。
83、项12.根据项10或11的方法，其中该哺乳动物受试者为人、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗或猫。
84、项13.根据项10-12中任一项的方法，其中该哺乳动物受试者中的抗衰老治疗或预防包括，施用有效量的得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177及其tad2结合衍生物或其片段的肽。
85、项14.根据项10-13中任一项的方法，其中该tad2的磷酸化位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置，优选地，该tad2的磷酸化位于人p53的thr55或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
86、项15.根据项10-14中任一项的方法，还包括检测人p53的ser392、或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量，以及将该量与早前从该受试者取得的样本和/或对照样本中的量进行比较，其中磷酸化的增加还指示，该哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功和/或进展。
87、项16.根据项10-15中任一项的方法，其中该得自受试者的生物样本包含衰老细胞、肿瘤细胞、转移细胞、微转移细胞、和/或纤维化细胞，特别是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
88、项17.根据项10-16中任一项的方法，其中该受试者还接受抗衰老细胞化疗，例如抗癌化疗。
89、项18.与p53蛋白的tad特异性结合的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为根据项9的化合物或药物组合物，在预防或治疗衰老细胞中的用途，其中该衰老细胞，与对照细胞相比，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53tad的类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白体的量的增加。
90、项19.根据项18的抗衰老化合物或药物组合物的用途，其中该衰老细胞，与对照细胞相比，展现出人p53的ser392、或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。
91、项20.根据项18或19的抗衰老化合物或药物组合物的用途，其中该衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞如三阴性乳腺癌细胞、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
92、项21.一种用于在受试者中预防或治疗衰老细胞的方法，其中衰老细胞，当与对照细胞相比时，展现出人p53的ser46和/或thr55、其他哺乳动物p53 tad中类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白的量的增加，和/或磷酸化p53与pml的共定位的增加，包括向受试者施用有效量的与p53蛋白tad特异性结合的抗衰老化合物或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选根据项9的化合物或药物组合物。
93、项22.根据项21的方法，其中该衰老细胞，与对照细胞相比时，还展现出人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。
94、项23.根据项21或22的方法，其中该衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞如三阴性乳腺癌细胞、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
95、项24.一种诊断试剂盒，其包含用于实施根据项1-8以及10-17中任一项的方法的材料，位于一个或分开的容器中，任选地与用于实施该方法的辅助剂和/或说明书一起。
96、项25.根据项24的试剂盒在根据项1-8以及10-17中任一项的方法中的用途，用于识别抗衰老化合物，用于在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防，和/或用于在哺乳动物受试者中对抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后。
1.一种用于识别改进的抗衰老化合物的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中该接触是体内或体外的，在溶液中或包含与固相载体结合或偶联的该哺乳动物p53蛋白的tad或该抗衰老候选分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该抗衰老候选分子选自化学分子、选自有机小分子库的分子、选择组合库的分子、细胞提取物特别是植物细胞提取物、小分子药物、蛋白、蛋白片段、选自肽库的分子、抗体或其片段，特别是得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合肽、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177或其核心序列的肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中对该结合的检测包括检测磷酸化，包括放射性标记32p正磷酸盐、磷酸化特异性抗体、和/或质谱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该哺乳动物p53蛋白的tad选自人、小鼠、大鼠、猴、绵羊、山羊、仓鼠、狗和猫p53蛋白的tad1和/或tad2，任选地作为全长p53蛋白的一部分，特别是重组p53蛋白，含有在人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的全长p53蛋白，包含该tad1和/或tad2、或该tad1或tad2的磷酸化片段的重组融合蛋白，及其突变体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该tad1的磷酸化位于人p53的ser15和/或ser20，和/或该tad2的磷酸化位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53tad的类似位置。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中对该结合的检测还包括，当可行的时候，检测人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化，以及将该特异性结合与不存在该磷酸化氨基酸情况下的进行比较。
8.一种抗衰老化合物，由权利要求1-7中任一项所述的方法所识别，或一种包含该抗衰老化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
9.一种用于在有需要的哺乳动物受试者中监控抗衰老治疗或预防的方法，其中哺乳动物优选为人，包括：
10.一种用于在哺乳动物受试者中对抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性进行预测或预后的方法，其中哺乳动物优选为人，包括实施权利要求9所述的方法，其中磷酸化和/或pml蛋白体的量和/或磷酸化p53与pml的共定位的增加，指示该哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功、进展和/或敏感性。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中该哺乳动物受试者中的抗衰老治疗或预防包括，施用有效量的得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽、包含得自哺乳动物foxo4蛋白的逆序翻转肽的融合蛋白、及其衍生物，优选为选自cl04183、cl04124和cl04177及其tad2结合衍生物或片段例如核心序列的肽。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中该tad2的磷酸化位于人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，还包括检测人p53的ser392、或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量，以及将该量与早前从该受试者取得的样本和/或对照样本中的量进行比较，其中磷酸化的增加还指示出，该哺乳动物受试者中抗衰老治疗或预防的成功和/或进展。
14.与p53蛋白的tad特异性结合的抗衰老化合物、或包含该抗衰老化合物的药物组合物，优选为权利要求8所述的化合物或药物组合物，在预防或治疗衰老细胞中的用途，其中该衰老细胞，与对照细胞相比，展现出人p53的ser46和/或thr55、或其他哺乳动物p53 tad的类似位置的磷酸化的量的增加，和/或pml蛋白体的量的增加，其中优选地，该衰老细胞，相比于对照细胞，还展示出人p53的ser392或其他哺乳动物p53蛋白的类似位置的磷酸化的量的增加。
15.根据权利要求14所述的抗衰老化合物或药物组合物的用途，其中该衰老细胞选自肿瘤细胞、转移肿瘤细胞、肿瘤微转移和/或大转移的细胞、纤维化细胞、乳腺癌细胞如三阴性乳腺癌细胞、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、和/或肝癌细胞或其转移细胞。
