本发明属于肿瘤生物制品领域，涉及过继免疫治疗中的一种分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞(fap-pd-1/nb car-t细胞)及其制备方法和应用。
背景技术：
1、近年来，肿瘤治疗有了突破性进展，免疫疗法是目前肿瘤治疗的热点之一。t细胞是人体内抗肿瘤的重要免疫细胞，人体通过t细胞受体(tcr)识别肿瘤抗原。但不是所有的tcr都能针对肿瘤抗原，因此人们利用基因工程技术为t细胞装上特异性识别肿瘤抗原的嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,car)使其表达针对肿瘤抗原的受体进而靶向杀伤肿瘤的免疫新疗法。2017年car-t治疗产品kymriah上市，首次用于治疗血液肿瘤，取得了较好的疗效。然而，在实体瘤治疗过程中由于肿瘤复杂的免疫抑制微环境等因素抑制了car-t细胞的功能，使得car-t在该领域进展相对缓慢。
2、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,cafs)是肿瘤免疫抑制微环境中一类异常分化且占据大部分细胞比例的间质细胞。成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,fap)是cafs的特异性标记物，其在部分肿瘤细胞和间质细胞都有表达。
3、程序性死亡受体1(programmed death-1,pd-1)是t细胞活化的负调控蛋白，它与程序性死亡配体1和2(pd-l1和pd-l2)结合，抑制t细胞活化。靶向这一通路的药物有助于重新激活t细胞，并重新激活抗肿瘤免疫应答。pd-1单克隆抗体药物即可以提高t细胞抗肿瘤效应，在临床应用取得了良好的效果。本研究通过构建活性强且同时靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞的car-t细胞以期在实体瘤治疗中达到更好的治疗效果。
4、另外，car-t细胞靶向性的关键成分目前主要以单链抗体(single chainvariable fragment,scfv)为主。传统单链抗体存在容易发生轻链和重链错配以及需要优化连接铰链区等问题。纳米抗体(nanobody,nb)(单域抗体)是近年来发现的一种天然的新型抗体，具有体积小、容易表达、可溶性好、稳定性强等优点，其在基础研究、新药开发、疾病诊断与治疗方面具有广阔的研究前景，成为各国竞相研究开发的对象。本发明成功构建了分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞(fap-pd-1/nb car-t细胞)，探索其在实体瘤中的治疗效果。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种工程化分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞，另一个目的是提供所述car-t细胞的制备方法以及提供所述car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种工程化分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞，所述car-t细胞是嵌合抗原受体fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp修饰的t细胞。
4、所述的分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞，其中所述嵌合抗原受体fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。
5、一种所述car-t细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：设计car目的序列，通过pcr法获得fap/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires-gfp的car目的序列片段，将酶切后的慢病毒载体与pcr法得到的car目的序列重组，将重组后的慢病毒载体转化至大肠杆菌中，并且筛选阳性克隆菌，对阳性克隆菌测序来验证是否成功构建含有fap-pd-1/nb car序列的慢病毒载体，对测序成功的重组阳性克隆菌株提取质粒，转染至待转染细胞后通过rt-pcr鉴定fap-pd-1/nb car序列在细胞中的表达情况，验证重组慢病毒载体能正常表达后包装慢病毒，制备t细胞，利用慢病毒感染技术构建所述car-t细胞。
6、一种如上述的car-t细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
7、(1)含有car目的序列重组慢病毒载体构建：pcr法获得fap/nb-histag-cd8-cd137(4-1bb)-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires-gfp的car目的序列片段，并将合成的片段亚克隆至bamhi/ecori双酶切后的慢病毒载体gv400中，将重组后的慢病毒载体转化至dh5α大肠杆菌中，采用慢病毒载体上的引物和目的基因上的引物对氨苄抗生素筛选后的菌落进行pcr鉴定，将鉴定成功的菌液进行测序，测序成功使用plasmid mini kit进行质粒抽提，获得含有car目的序列的质粒；
8、(2)慢病毒包装：采用三质粒系统，将含有car目的序列的质粒通过两种辅助质粒helper1.0和helper2.0共转染293t细胞，48h后在荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白(gfp)表达，成功表达荧光则收集293t细胞上清，经过浓缩纯化，采用荧光稀释法测定病毒浓度，计数绿色荧光蛋白阳性细胞个数，按照公式：病毒浓度＝荧光细胞数/该孔病毒原液体积，来计算病毒滴度；
9、(3)t细胞制备：分离外周血的单个核细胞，进行培养获得t细胞；
10、(4)fap-pd-1/nb car-t细胞制备：用含有人cd3单克隆抗体、人cd28单克隆抗体和人il-2细胞因子的专用t细胞培养基培养t细胞24小时，次日按照moi 20将慢病毒液加入以上刺激后的t细胞中，在37℃co2培养箱培养48h，将car-t细胞置于普通显微镜下，观察car-t细胞的gfp表达情况。
11、在所述步骤(4)中，待慢病毒感染后的t细胞的细胞量占培养瓶80-90％时将细胞收集换液，加入终浓度为100u/ml的il-2的完全培养液进行扩增培养，采用流式细胞仪对感染的细胞进行鉴定。
12、如上述的制备方法，其中所述car-t细胞是采用慢病毒感染技术进行制备的。
13、一种所述的分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
14、如上述的应用，优选的，所述的肿瘤是指fap阳性肿瘤。
15、一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞和药学上可接受的载体。
16、一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体为fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp。
17、一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp。
18、本发明的研究者发现在对fap阳性肿瘤免疫治疗中，分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞的优势在于特异性的靶向，即增强免疫细胞靶向识别肿瘤抗原，此外还增强了嵌合抗原受体依赖的肿瘤杀伤活性以及输注后在肿瘤部位的浸润，降低t细胞耗竭。fap-pd-1/nb car-t所拥有的这些特性源于嵌合抗原受体的功能结构，主要包含抗原识别区域及细胞内激活区域，细胞内激活区域能延长细胞在体内的存活时间。另外本发明采用慢病毒感染进行制备car-t细胞，提供了一种高效制备fap-pd-1/nb car-t的方法，该方法制备的car-t能稳定表达嵌合抗原受体，具有较好的应用前景。
1.一种分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞是嵌合抗原受体fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp修饰的t细胞，所述嵌合抗原受体fapnb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp的核苷酸序列包含如seq id no.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的car-t细胞，其中所述嵌合抗原受体fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp的核苷酸序列为如seq id no.1所示的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：设计car目的序列，通过pcr法获得fap/nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-2a-pd-1nb-ires-gfp的car目的序列片段，将酶切后的慢病毒载体与pcr法得到的car目的序列重组，将重组后的慢病毒载体转化至大肠杆菌中，并且筛选阳性克隆菌，对阳性克隆菌测序来验证是否成功构建含有fap-pd-1/nb car序列的慢病毒载体，对测序成功的重组阳性克隆菌株提取质粒，转染至待转染细胞后通过rt-pcr鉴定fap-pd-1/nb car序列在细胞中的表达情况，验证重组慢病毒载体能正常表达后包装慢病毒，制备t细胞，利用慢病毒感染技术构建所述car-t细胞。
4.一种如权利要求3所述的car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的制备方法，其中在步骤(4)中，待慢病毒感染后的t细胞的细胞量占培养瓶80-90％时将细胞收集换液，加入终浓度为100u/ml的il-2的完全培养液进行扩增培养，采用流式细胞仪对感染的细胞进行鉴定。
6.一种如权利要求1或2所述的分泌pd-1单域抗体靶向fap的car-t细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其中所述的肿瘤是指fap阳性肿瘤。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的car-t细胞和药学上可接受的载体。
9.一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体为fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp，所述核苷酸序列为seq id no.1。
10.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为fap nb-histag-cd8-cd137-cd3ζ-pd-1nb-gfp，所述嵌合抗原受体由如seq id no.1所示的核苷酸序列编码。
