1.本发明涉及一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法，属于中成药质量检测方法领域。
背景技术：2.本发明所述药品为参仙升脉口服液，该药品是山东步长制药股份的独家品种。国家药品监督管理局批准文号为国药准字z20080183(10ml)、其主要由乙酰谷酰胺和中药材红花组配而成配伍组成，本技术人对该产品布局多件专利申请，其申请号为：200710019161.5、201010275244.2、202010831085.3，上述专利技术保护主题为：该参仙升脉中药组方配比、临床治疗糖尿病新用途、口服液挥发性成分检测方法等。目前该药品国家质量标准为ws3-065(z-010)-2003(z)，该标准中以人参皂苷rb1、re、rg、盐酸麻黄碱、补骨脂素、异补骨脂素、淫羊藿苷、原儿茶醛的薄层含量定性鉴别。其中本品以每支含红参以人参皂苷rg1进行单指标成分含量检测。
3.参仙升脉口服液是我国第一个专门治疗缓慢性心律失常的专利中成药，具有温补心肾，活血化瘀的作用。现代临床上常用于治疗轻、中度窦房结心动过缓(心率》50次)和轻度病态窦房结综合征不合并有室上性快速心律失常的心肾阳虚，寒凝血脉证。全方由红参、淫羊藿、补骨脂(盐炙)、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭等八味中药组成。经查阅文献，仅发现参仙升脉口服液中单味药材的化学成分研究报道。其中，红参是经人参蒸制干燥而成，主要有效成分为人参皂苷，其特有成分为人参皂苷rg3；淫羊藿有效成分主要为淫羊藿总黄酮和淫羊藿多糖；补骨脂主要成分为补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮等；枸杞子活性成分主要为多糖类；麻黄主要成分为生物碱，含有麻黄碱、伪麻黄碱等；细辛、丹参、水蛭的主要成分分别为咖啡酰类、丹参酮类、水蛭素。目前，对于中药复方产品的研究多局限于方中单一中药的化学成分，缺乏对参仙升脉口服液整体化学物质基础的系统研究。然而对于传统的中医药而言，药物的临床疗效是中药复方中多种有效成分协同作用的共同结果，单一中药成分的分析并不能够体现中药复方的整体性和化学成分的复杂多样性。然而单一的指标质控成分并不能从整体上反应该中药复方制剂的内在质量，因此有必要开展该产品的中药复方物质成分研究。
技术实现要素：4.本发明提供一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法，该检测方法采用uhplc-q exactive focus ms/ms技术手段，经对照品比对确认，本发明检测方法共鉴定出160个化学成分，包括29个黄酮类成分，24个有机酸类成分，21个生物碱类成分，19个萜类成分，15个苯丙素类成分，12个皂苷类成分和40个其他类成分；其中6个化学成分(芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚)。本发明检测方法能够对参仙升脉口服液的有效物质成分进行快速有效的全面表征，并进一步对所鉴定成分进行药味、类别归属，为参仙升脉口服液的有效成分物质基础研究和质量控制提供参考依据。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
7.⑴
、对照品溶液的制备：称取芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为对照品贮备液；再用甲醇将各对照品贮备液稀释至适宜浓度，即得；
8.⑵
、供试品溶液的制备：取参仙升脉口服液，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
9.⑶
、色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相采用甲醇(a)和0.07～0.12％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为0～13min，5％～60％a；13～27min，60％～95％a；27～30min，95％a，流速0.1～0.5ml
·
min-1
，进样量1～3μl，柱温25～35℃；
10.⑷
、质谱条件为：离子源为加热电喷雾离子源(h-esi)，喷雾电压为3～5kv，鞘气(n2)流量30～50arb，辅助气流量8～12arb，辅助加热器温度330～370℃，毛细管温度310～330℃，s-lens射频水平45～55，自动增益控制(agc)100～110，扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，full ms分辨率60000～80000，dd-ms2分辨率30000～40000；扫描范围m/z 100～2000，碰撞能量20～8ev；
11.⑸
、数据处理：根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子，与参仙升脉口服液化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息，采用xcalibur 2.0软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。
12.优选的，所述检测方法步骤
⑴
对照品溶液的制备中对照品溶液的浓度为0.5～2ug/ml。
13.优选的，所述检测方法步骤
⑴
对照品溶液的制备中对照品溶液的浓度为1ug/ml。
14.优选的，所述检测方法步骤
⑵
供试品溶液的制备中，所述甲醇稀释的倍数8～12倍，最佳优选为10倍。
15.优选的，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件为：所述色谱柱的型号为：thermo accucore aq。
16.优选的，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件为：流动相采用甲醇(a)和0.1％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为0～13min，5％～60％a；13～27min，60％～95％a；27～30min，95％a，流速0.3ml
·
min-1
；，进样量2μl，柱温30℃。
17.优选的，所述检测方法步骤
⑷
质谱条件为：喷雾电压为3.5kv，鞘气(n2)流量40arb，辅助气流量10arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，s-lens射频水平50，自动增益控制(agc)106，扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，full ms分辨率70000，dd-ms2分辨率35000；扫描范围m/z 120～1 800，碰撞能量30ev、50ev、70ev。
18.本发明检测条件色谱和质谱条件的优化：
19.①
、色谱条件
20.本实验针对流动相选择了甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液和乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱，结果发现流动相中加入少量酸，能有效改善峰形及离子化效果。甲醇和乙腈的比较并未发现二者对峰形有较大影响，因此，最终选用甲醇-0.1％甲酸水溶液为流动相。根据整体离子峰的信号强度，考察了进样量1μl、2μl和3μl，结果进样量为2μl时，整体离子信号强度较为理想。
21.②
、质谱条件
22.为了更加系统、全面地对参仙升脉口服液中的化学成分进行快速识别，本实验采用全扫描和正、负离子切换模式进行监测，并对碰撞能量进行了优化。分别设置碰撞能量为15ev、20ev、30ev、40ev、50ev、60ev、70ev，结果发现碰撞能量为30ev、50ev、70ev时，既可保留化学成分的一级离子信息，又可得到较为丰富的二级碎片离子信息。
23.本发明检测方法的有益效果：
24.本发明检测方法采用uhplc-q exactive focus ms/ms技术，并对参仙升脉口服液中的化学成分进行了快速分析鉴定，共鉴定出160个化合物，其结构类型主要分为以下几类：黄酮类、皂苷类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类、萜类等。其中，黄酮类、皂苷类、生物碱类和萜类化合物主要归属于药材淫羊藿、红参、麻黄和丹参。且该检测方法具有高分辨率、高灵敏度、快速分析数据的显著优点。
25.现代药理学研究表明，黄酮、生物碱和皂苷类化合物对心血管疾病具有显著的药理活性；某些苯丙素和有机酸类成分如咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸等能抑制血小板聚集、抗血栓；萜类化合物可能具有一定的强心作用。已有研究表明红参、淫羊藿和丹参具有保护心血管、抗心律失常作用，人参皂苷rb1可通过抑制tgf-β通路和periostin蛋白表达，有效防治心力衰竭；淫羊藿总黄酮苷可以阻滞β受体，减少na
+
、ca
2+
内流，从而降低自律性；丹参酮ⅱa是潜在的改善血液微循环，预防脑血管疾病的有效药物，丹参酮ⅱa能升高心型脂肪酸结合蛋白水平，降低心肌组织缺血修饰白蛋白水平，对心肌缺血再灌注损伤及心律失常具有良好的防治作用。此外，补骨脂中香豆素类成分具有保护心血管系统作用，补骨脂素能够减少tnf-α诱导人脐静脉内皮细胞的组织因子释放，降低血栓形成风险。由此可知，本发明所检测的黄酮类、皂苷类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类、萜类等。其中，黄酮类、皂苷类、生物碱类都属于参仙升脉口服液的有效物质成分，从而揭示该产品发挥治疗缓慢性心律失常的作用与这些成分有着密切的联系，为进一步明确其药效物质基础及质量控制奠定了实验基础。
附图说明
26.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
27.图1-参仙升脉口服液uhplc-q exactive focus ms/ms总离子流图(a.正离子模式，b.负离子模式)；
28.图2-淫羊藿苷可能裂解途径；
29.图3-丹参素可能裂解途径；
30.图4-麻黄碱可能裂解途径；
31.图5-丹参酮ⅱa可能裂解途径；
32.图6-补骨脂苷可能裂解途径；
33.图7-人参皂苷rg1可能裂解途径。
具体实施方式
34.为了更加充分理解本发明的实施，下面列举一个实验例，下面通过典型的实施例
对本发明做进一步的说明。
35.实施例1本发明超高效液相检测方法
36.1材料
37.1.1仪器
38.ultimate 3000型超高效液相色谱系统和q exactive focus型质谱仪(美国thermo fisher scientific公司)；mill-q超纯水机(美国millipore公司)；sqp型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
39.1.2药物与试剂
40.参仙升脉口服液(批号181202)由陕西步长制药有限公司提供；芦丁对照品(批号100080-201811)购自中国食品药品检定研究院，补骨脂苷对照品(批号chb-b-163)、异补骨脂苷对照品(批号chb-y-280)、补骨脂酚对照品(批号chb-b-099)购自成都克洛玛生物科技有限公司，补骨脂素(批号110739-200310)、异补骨脂素(批号0738-200108)购自中国药品生物制品检定所，所有对照品纯度均＞98％；甲醇为色谱级，甲酸为质谱级(美国thermo fisher scientific公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
41.2方法
42.2.1溶液的制备
43.2.1.1对照品溶液的制备
44.精密称取芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为对照品贮备液；再用甲醇将各对照品贮备液稀释至适宜浓度，即得各对照品溶液。
45.2.1.2样品溶液的制备
46.取1ml参仙升脉口服液内容物于10ml容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
47.2.2检测条件
48.2.2.1色谱条件
49.thermo accucore aq c
18
色谱柱(150mm
×
2.1mm，2.6μm)；流动相采用甲醇(a)和0.1％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为0～13min，5％～60％a；13～27min，60％～95％a；27～30min，95％a。流速0.3ml
·
min-1
；进样量2μl；柱温30℃。
50.2.2.2质谱条件
51.离子源为加热电喷雾离子源(h-esi)，喷雾电压为3.5kv，鞘气(n2)流量40arb，辅助气流量10arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，s-lens射频水平50，自动增益控制(agc)106。扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，full ms分辨率70 000，dd-ms2分辨率35 000；扫描范围m/z 120～1 800，碰撞能量30ev、50ev、70ev。
52.2.3数据处理
53.根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子与自建的参仙升脉口服液化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息。采用xcalibur2.0软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。
54.3检测结果
55.利用uhplc-q exactive focus ms/ms，通过对不同离子模式下的供试品基峰总离子流图(可参见说明书附图1)对比可以看出，参仙升脉口服液在正负离子模式下响应均较好，在0～30min内均有密集的响应信号，大部分化合物均有出峰，随着流动相极性的降低，化合物出峰变少，表明参仙升脉口服液中主要以极性化合物为主。从参仙升脉口服液中共检测到160种化学成分，其中响应度高，具有二级碎片离子的化学成分有62种，其他成分因自身含量低或离子化能力弱，从而未发生裂解产生相应的碎片离子，具体化合物信息见表1。
56.表1参仙升脉口服液化学成分的uhplc-q exactive focus ms/ms鉴定结果
57.58.59.60.61.62.63.64.65.66.[0067][0068][0069]
注：
*
经对照品比对确认。
[0070]
3.1黄酮类
[0071]
绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，本研究从参仙升脉口服液中鉴定的黄酮类成分共有29种，主要包括淫羊藿苷、宝藿苷ⅶ、朝藿定a和大豆苷等。以114号代表性化合物淫羊藿苷质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z 677.24[m+h]
+
，拟合其分子式为c
33h39o15
，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z531.19[m+h-c6h9o4]
+
，m/z 369.13[m+h-c6h9o
4-c6h
10
o5]
+
，相应质谱裂解途径见附图2。
[0072]
3.2有机酸类
[0073]
从参仙升脉口服液中鉴定的有机酸类成分有24种，主要包括丹参素、咖啡酸、异亮氨酸、烟酸和琥珀酸等。以44号代表性化合物丹参素质谱裂解过程为例，在负离子模式下可见准分子离子峰m/z 197.05[m-h]-，拟合其分子式为c9h
10
o5，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z 135.05[m-h-h2o-co2]-，m/z 123.05[m-h-c2h2o3]-，相应质谱裂解途径见图3。
[0074]
3.3生物碱类
[0075]
从参仙升脉口服液中鉴定的生物碱类成分有21种，主要包括麻黄碱、甲基麻黄碱、木兰花碱、肌苷和腺苷等。以47号代表性化合物麻黄碱质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z 166.12[m+h]
+
，拟合其分子式为c
10h15
no，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z 121.06[m+h-c2h7n]
+
，m/z 103.05[m+h-c2h7n-h2o]
+
，相应质谱裂解途径见图4。
[0076]
3.4萜类
[0077]
从参仙升脉口服液中鉴定的萜类成分有19种，主要包括丹参酮iia、表丹参隐螺内酯和α-蒎烯等。以147号代表性化合物丹参酮iia质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z 317.11[m+na]
+
，拟合其分子式为c
19h18
o3，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z 69.07[m+na-c
14
h9o3na]
+
，m/z 67.05[m+na-c
14
h9o3na-h2]
+
，相应质谱裂解途径见图5。
[0078]
3.5苯丙素类
[0079]
从参仙升脉口服液中鉴定的苯丙素类成分有15种，主要包括补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素和异补骨脂素等。
[0080]
以65号代表性化合物补骨脂苷质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z 389.08[m+na]
+
，拟合其分子式为c
17h18
o9，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z 227.03[m+na-c6h
10
o5]
+
，m/z 185.04[m+na-c
11
h8o4]
+
，相应质谱裂解途径见图6。
[0081]
3.6皂苷类
[0082]
从参仙升脉口服液中鉴定的皂苷类成分有12种，主要包括人参皂苷rg1、人参皂苷re和人参皂苷rb1等。以105号代表性化合物人参皂苷rg1质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z 823.48[m+na]
+
，拟合其分子式为c
42h72o14
，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z 643.42[m+na-c6h
12
o6]
+
，m/z 203.05[m+na-c
36h60
o8]
+
，相应质谱裂解途径见图7。
[0083]
3.7其他类
[0084]
此外，本研究还从参仙升脉口服液中鉴定出了多种其他类化合物，包括10种酯类，9种糖类，8种挥发油类，7种酚类和6种黄酮类，具体检测结果见表1。
[0085]
最后应说明是：本发明所并不局限于上述具体实施方案，上述的具体实施方案仅
仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
⑴
、对照品溶液的制备：称取芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为对照品贮备液；再用甲醇将各对照品贮备液稀释至适宜浓度，即得；
⑵
、供试品溶液的制备：取参仙升脉口服液，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
⑶
、色谱检测条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相采用甲醇(a)和0.07～0.12％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为0～13min，5％～60％a；13～27min，60％～95％a；27～30min，95％a，流速0.1～0.5ml
·
min-1
，进样量1～3μl，柱温25～35℃；
⑷
、质谱条件为：离子源为加热电喷雾离子源(h-esi)，喷雾电压为3～5kv，鞘气(n2)流量30～50arb，辅助气流量8～12arb，辅助加热器温度330～370℃，毛细管温度310～330℃，s-lens射频水平45～55，自动增益控制(agc)100～110，扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，fullms分辨率60000～80000，dd-ms2分辨率30000～40000；扫描范围m/z100～2000，碰撞能量20～8ev；
⑸
、数据处理：根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子，与参仙升脉口服液化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息，采用xcalibur 2.0软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。2.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑴
对照品溶液的制备中对照品溶液的浓度为0.5～2ug/ml。3.如权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑴
对照品溶液的制备中对照品溶液的浓度为1ug/ml。4.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑵
供试品溶液的制备中，所述甲醇稀释的倍数8～12倍。5.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件为：所述色谱柱的型号为：thermo accucore aq。6.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑶
色谱检测条件为：流动相采用甲醇(a)和0.1％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为0～13min，5％～60％a；13～27min，60％～95％a；27～30min，95％a，流速0.3ml
·
min-1
；，进样量2μl，柱温30℃。7.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤
⑷
质谱条件为：喷雾电压为3.5kv，鞘气(n2)流量40arb，辅助气流量10arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，s-lens射频水平50，自动增益控制(agc)106，扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，full ms分辨率70000，dd-ms2分辨率35000；扫描范围m/z 120～1800，碰撞能量30ev、50ev、70ev。
技术总结本发明提供一种参仙升脉口服液超高效液相检测方法，该检测方法采用UHPLC-QExactive Focus MS/MS技术手段，本发明检测方法共鉴定出160个化学成分，包括29个黄酮类成分，24个有机酸类成分，21个生物碱类成分，19个萜类成分，15个苯丙素类成分，12个皂苷类成分和40个其他类成分；其中6个化学成分(芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚)。本发明检测方法能够对参仙升脉口服液的有效物质成分进行快速有效的全面表征，为该产品质量控制及标准提升提供参考依据。控制及标准提升提供参考依据。
技术研发人员：李晔 刘峰 刘洋 宗时宇 张红 孙婷婷 王春柳 龙凯花
受保护的技术使用者：山东步长制药股份有限公司
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2022/11/1
