本说明书涉及用于将多种多肽负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的合成肽穿梭剂。更具体地，本说明书涉及在合理设计这种合成肽穿梭剂中有用的参数。
背景技术：
1、将大分子运输入真核细胞内的细胞递送技术具有广泛的应用，特别是在生物制药工业中。尽管一些可溶性的化学物质(例如小分子药物)可被动地扩散通过真核细胞膜，但较大负荷(例如生物制剂、多核苷酸和多肽)需要穿梭剂的帮助以达到其细胞内靶标。
2、可以从细胞递送技术的进步中获益的领域包括基因组编辑和细胞疗法领域，这些领域在过去二十年中取得了巨大的飞跃。解读控制细胞扩增、分化和重新编程的不同生长因子和分子线索为治疗未满足的医疗需求打开了许多治疗可能性的大门。例如，直接从成体细胞诱导多能干细胞，直接细胞转化(转分化)和基因组编辑(锌指核酸酶，talen和crispr相关核酸内切酶技术)是已经开发以最大化用于临床应用的细胞治疗价值的方法实例。目前，具有高治疗活性的细胞的生产通常需要离体操作，主要通过病毒转导实现，从而为人类应用提出了重要的安全性和经济问题。在这些细胞内直接递送活性蛋白质如转录因子或人工核酸酶的能力可有利地避免与更危险的基因转移方法相关的安全性问题和调节障碍。特别是，非常需要在免疫细胞中直接递送活性基因组编辑复合物以改善免疫疗法的方法。
3、涉及将重组蛋白质负荷直接融合到细胞穿透肽(例如hiv反式激活蛋白质tat)的蛋白质转导方法需要大量的重组蛋白质并且经常不能将负荷递送到适当的亚细胞位置，导致大量的内体捕获和最终退化。已经开发了几种内体膜破坏肽以试图促进内体捕获的负荷逃逸到胞质溶胶中。然而，许多这些内体溶解肽已被用于减轻已经在细胞内递送的负荷的内体截留，并且它们本身不能帮助在细胞内穿过质膜穿梭负荷的初始步骤(salomone等人，2012；salomone等人，2013；erazo-oliveras等人，2014；fasoli等人，2014)。
4、特别地，salomone等人，2012描述了嵌合肽cm18-tat11，其由tat11细胞穿透基序与cm18杂合体(天蚕素-a的残基1-7和蜂毒肽的残基2-12)的融合产生。据报道，该肽被细胞快速内化(由于其tat基序)，并且随后导致内吞囊泡的膜不稳定(由于cm18肽的膜破坏能力)。虽然报道了与荧光标记atto-633(分子量为774da；21％的肽的mw)融合的肽cm18-tat11促进内体被捕获的tat11-egfp逃逸到胞质溶胶中(参见salomone等人，2012的图3)，cm18-tat11肽(单独或与atto-633结合)未显示作为可以增加多肽负荷从细胞外空间递送到细胞内-即穿过质膜的穿梭剂。事实上，salomone等人，2012比较了联合治疗(同时治疗tat11-egfp和cm18 tat11-atto-633)与时移治疗(即单独用tat11-egfp温育细胞，荧光成像，然后单独用cm18-tat11-atto-633肽温育相同的细胞，并再次进行荧光成像)，并且作者报道“两者都产生了相同的递送结果”(参见salomone等人，2012的第295页，在“2.9负荷递送测定”标题下的第一段最后一句)。换句话说，salomone等人，2012描述了肽cm18 tat11(单独或与atto-633缀合)对多肽负荷从细胞外空间递送到细胞内部(即蛋白质转导)没有影响。因此，仍然需要改进的穿梭剂，其能够提高多肽负荷的转导效率，并将负荷输送到靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。
5、本说明书涉及许多文献，其内容通过引用整体并入本文。
技术实现思路
1、筛选多种不同的肽，目的是鉴定基于多肽的穿梭剂，其可以将独立的多肽负荷细胞内递送至真核细胞的胞质溶胶/细胞核。一方面，这些大规模的筛选努力导致了令人惊讶的发现，即某些基于结构域的肽穿梭剂通过增加最终内化多肽负荷的细胞的数量和/或比例来提高真核细胞中多肽负荷的转导效率，并且还使内化的负荷能够进入胞质溶胶/细胞核区室(从而避免或减少负荷内体捕获)。这些基于结构域的穿梭剂包含与细胞穿透结构域(cpd)可操作地连接的内体渗漏结构域(eld)，以及任选地一个或多个富含组氨酸的结构域。另一方面，上述筛选努力还揭示了一些肽没有或具有低多肽负荷转导活性、过度毒性和/或其它不期望的性质(例如差的溶解度和/或稳定性)。这些经验数据(正面和负面)在本文中用于鉴定成功的、不太成功的和失败的肽的生理化学性质，以便得到一组能够合理设计和/或鉴定具有蛋白质转导活性的肽的设计参数。
2、因此，本说明书涉及通过在如本文所述的肽穿梭剂的存在下使细胞与多肽负荷接触，将多肽负荷从细胞外空间递送至靶细胞和/或靶真核细胞的细胞核的方法，与不存在穿梭剂时相比，浓度足以增加多肽负荷的转导效率。更具体地，本说明书涉及可用于合理设计这种合成肽穿梭剂的参数，满足一个或多个这些设计参数的肽穿梭剂，以及涉及使用合成肽穿梭剂将多种多肽负荷从细胞外空间递送至靶真核细胞的胞质溶胶和/或细胞核的方法和组合物。本说明书还涉及机器学习或计算机辅助方法，其可用于产生尊重本文所述的一个或多个设计参数的肽变体。
3、本说明书还涉及共转导目标多肽负荷和标记蛋白，作为鉴定和/或富集转导细胞的手段。令人惊讶地发现，用标记蛋白成功转导了用目标多肽负荷成功转导的显著高比例的靶真核细胞。相反，未用目标多肽负荷转导的显著高比例的细胞也未用标记蛋白转导。分离标记蛋白阳性的细胞(例如通过facs)导致用目标多肽负荷成功转导的细胞比例显著增加，并且发现相关性浓度依赖于表现出最高的细胞群。标记蛋白的荧光也倾向于表现出与目标多肽负荷转导的最高比例。还发现，在用目标多肽负荷进行第一轮转导后未成功转导的细胞可以分离并在随后的转导循环中用目标多肽负荷重新转导。因此，在一些方面，本说明书涉及包括与标记蛋白共转导目标多肽负荷的方法，其中标记蛋白可用于分离或富集用目标多肽负荷转导的细胞。在一些实施方式中，本说明书还涉及包括在例如在第一次或之前的转导反应后未用标记蛋白成功转导的细胞上进行的重复连续转导实验的方法。此类方法提出了在有价值的细胞群(例如用于细胞疗法的源自患者的细胞)和/或本身更难以转导的细胞群中提高转导效率的有吸引力的方法。
4、一般性定义
5、提供标题和其它标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等仅仅是为了便于阅读说明书和权利要求书。在说明书或权利要求书中使用标题或其它标识符不一定要求以字母或数字顺序或其呈现的顺序来执行步骤或元素。
6、当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，使用词语“一”或“一个”可以表示“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
7、术语“约”用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的标准偏差。一般来说，术语“约”意味着指定高达10％的可能变化。因此，术语“约”包含1、2、3、4、5、6、7、8、9和10％的值的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两端。
8、如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(以及包含的任何形式，诸如“包含”和“包含”)、“具有”(以及具有的任何形式诸如“具有”和“具有”)、“包括”(以及包括的任何形式诸如“包括”和“包括”)或“包含”(以及包含的任何形式，如“包含”和“包含”)是包容性的或开放式的且不排除额外、未记载的元素或方法步骤。
9、如本文所用，“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指氨基酸的任何肽连接的链，其可以包含或可以不包含任何类型的修饰(例如翻译后修饰如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化、sumo化、异戊烯化、泛素化等)。为了进一步清楚，设想了蛋白质/多肽/肽修饰，只要该修饰不破坏本文所述的穿梭剂的蛋白质转导活性即可。
10、如本文所用，“结构域”或“蛋白质结构域”通常是指具有特定功能性或功能的蛋白质的一部分。一些结构域在与蛋白质的其余部分分离时保留其功能，因此可以以模块化方式使用。许多蛋白质结构域的模块化特征可以在它们放置在本说明书的穿梭剂中方面提供灵活性。然而，当在穿梭剂的某些位置(例如在n-或c-末端区域或其间)设计时，一些结构域可以表现得更好。结构域在其内源蛋白质中的位置有时是应该在穿梭剂内设计结构域的位置以及应该使用何种类型/长度的接头的指示。鉴于本公开，技术人员可以使用标准重组dna技术来操纵本说明书的穿梭剂内的结构域的位置和/或数量。此外，本文公开的测定法以及本领域已知的其它测定法可用于评估穿梭剂内的每个结构域的功能性(例如它们促进细胞穿过质膜，内体逃逸和/或接近胞质溶胶的能力)。标准方法也可用于评估穿梭剂的结构域是否影响待在细胞内递送的负荷的活性。在这方面，本文所用的表述“可操作地连接”是指结构域在本说明书的穿梭剂环境中实现其预期功能(例如细胞穿透，内体逃逸和/或亚细胞靶向)的能力。为了更清楚，表述“可操作地链接”意在定义两个或更多个域之间的功能连接，而不限于它们之间的特定顺序或距离。
11、如本文所用，术语“合成肽”或“合成多肽”中使用的术语“合成”意指可以在体外产生的非天然存在的分子(例如，化学合成和/或使用重组dna技术产生的分子)。各种合成制剂的纯度可以通过例如高效液相色谱分析和质谱来评估。化学合成方法可能优于细胞表达系统(例如酵母或细菌蛋白质表达系统)，因为它们可能排除了对广泛的重组蛋白质纯化步骤的需要(例如临床使用所需)。相反，较长的合成多肽可能通过化学合成方法更复杂和/或更昂贵，并且可以使用细胞表达系统更有利地产生此类多肽。在一些实施方式中，与从重组宿主细胞表达相反，本说明书中的肽或穿梭剂可以是化学合成的(例如固相或液相肽合成)。在一些实施方式中，本说明书的肽或穿梭剂可缺少n-末端甲硫氨酸残基。本领域技术人员可以通过使用一种或多种修饰的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)或通过化学修饰本说明书的合成肽或穿梭剂来适应本说明书的合成肽或穿梭剂，以满足稳定性或其它需要的特定需要。
12、当在本文中描述的穿梭剂的上下文中使用时，表述“基于多肽”旨在将目前描述的穿梭剂与非多肽或非蛋白质的穿梭剂(例如基于脂质或阳离子聚合物的转导剂)区分开，其通常与增加的细胞毒性相关，并且可能不适合用于人类治疗。
13、如本文所用，术语“独立的”通常是指不彼此共价结合的分子或试剂。例如，表述“独立多肽负荷”意指在细胞内递送的多肽负荷，其不与本说明书的穿梭剂共价结合(例如未融合)。在一些方面，具有独立于(未融合)多肽负荷的穿梭剂可能是有利的，因为提供增加的穿梭剂多功能性--例如，不需要为不同多肽负荷重新设计新的融合蛋白，和/或能够容易地改变穿梭剂与负荷的比例(与在融合蛋白的情况下限制为1：1的比例相反)。
14、如本文所用，表述“是或来自”或“来自”包括给定蛋白质结构域(cpd或eld)的功能变体，例如保守的氨基酸取代、缺失、修饰以及变体或功能衍生物，这不会消除蛋白质结构域的活性。
15、本说明书的其它目的、优势和特征将通过阅读以下仅参照附图以实例的方式给出的具体实施方式的非限制性描述而变得更加明显。
1.一种合成肽穿梭剂，其为：
2.根据权利要求1所述的合成肽穿梭剂，其中所述合成肽穿梭剂涉及参数(5)至(15)中的至少七个、至少八个、至少九个、至少十个，或涉及所有参数(5)至(15)。
3.根据权利要求1或2所述的合成肽穿梭剂，其中：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的合成肽穿梭剂，其中所述合成肽穿梭剂满足以下参数至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或满足以下全部参数：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的合成肽穿梭剂，其中所述合成肽穿梭剂进一步包含富集丝氨酸和/或甘氨酸残基的柔性接头结构域。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的合成肽穿梭剂，其中所述合成肽穿梭剂包含seqid no:113、104、105、107、108、110、111、112、114-131、133-135,138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10242中的任一者的氨基酸序列。
7.一种合成肽穿梭剂，所述合成肽穿梭剂包含与seq id no:113、104、105、107、108、110、111、112、114-131、133-135,138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10242中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列，或由其组成。
8.根据权利要求7所述的合成肽穿梭剂，其中所述合成肽穿梭剂包含seq id no:113、104、105、107、108、110、111、112、114-131、133-135,138、140、142、145、148、151、152、169-242和243-10242中的任一者的氨基酸序列，或由其组成。
9.一种组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所定义的合成肽穿梭剂，和从细胞外空间递送至靶哺乳动物细胞的胞质溶胶和/或细胞核的多肽负荷。
10.根据权利要求1至8中任一项所定义的合成肽穿梭剂在制备用于在体外或体内将多肽负荷从细胞外空间递送至靶哺乳动物细胞的胞质溶胶和/或细胞核的药物中的用途，其中所述合成肽穿梭剂以至少2.5μm的浓度使用，并且其中与不存在所述合成肽穿梭剂相比，所述合成肽穿梭剂的使用浓度足以提高所述多肽负荷转导至靶哺乳动物细胞的胞质溶胶和/或细胞核的转导效率。
11.一种哺乳动物细胞，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的合成肽穿梭剂。
