本发明属生物医学，具体涉及一种akap12突变基因敲入动物模型的构建方法和应用。
背景技术：
1、crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/crispr associated nuclease 9)基因编辑技术是一种由rna介导cas9蛋白对目的基因进行靶向修饰的技术。cas9是crispr相关核酸酶，含有两个核酸酶结构域，可在guide rna引导下，对靶基因位点的两条dna单链进行切割，使dna双链断裂，引发细胞自主dna损伤修复。如同时向细胞导入外源携带突变的dna片段，细胞自主dna损伤修复时可以此dna片段为模板进行修复，从而实现对目标位点的定点敲入，以及基因修正等多种修饰。
2、crispr/cas9技术在生物工程和生物医学方面有广泛的应用，可以快速建立基因突变的动物模型和细胞模型，用于探究遗传变异与疾病之间的关系。
3、自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,asd)，也称孤独症，是以社交交往障碍、语言交流障碍、以及兴趣狭窄及重复刻板行为为核心临床表现的脑神经系统发育障碍性疾病。该病严重影响患儿本人的神经精神卫生健康，对其致病机制仍不清楚。因此，如何建立稳定的、可以更好的模拟自闭症的临床特点的动物模型成为本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于crispr/cas9技术构建akap12突变基因敲入动物模型的方法和应用，为自闭症的机制研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种特异性靶向akap12突变基因的sgrna。
3、本发明第二方面的目的，在于一种试剂盒。
4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的sgrna或本发明第二方面的试剂盒在构建akap12突变基因敲入动物模型中的应用。
5、本发明第四方面的目的，在于提供一种基于crispr/cas9技术构建akap12突变基因敲入动物模型的方法。
6、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第五方面的akap12突变基因敲入动物模型在筛选预防和/或治疗自闭症的药物或自闭症的致病机制研究中的应用。
7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
8、本发明的第一个方面，提供一种特异性靶向akap12基因的sgrna，所述sgrna的序列包括：
9、sgrna1：gagctctgcgtcgtcccccgagg；和/或，
10、sgrna2：ggtctcctcaggctcctcggggg。
11、本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面的sgrna。
12、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括cas9 mrna和/或含有突变位点的同源载体，所述突变位点为c.1655-1659del。
13、在本发明一些实施方式中，所述含突变位点的同源载体的核苷酸序列如seq idno:3所示。
14、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括扩增引物、测序引物。
15、在本发明一些实施方式中，所述扩增引物包括seq id no:4和seq id no:5所示的引物对。
16、在本发明一些实施方式中，所述测序引物的序列如seq id no:6所示。
17、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的sgrna或本发明第二方面的试剂盒在构建akap12基因突变的动物模型中的应用。
18、在本发明一些实施方式中，所述动物模型为小鼠、大鼠、猴子中的一种。
19、在本发明一些优选实施方式中，所述动物模型为大鼠。
20、本发明的第四个方面，提供一种基于crispr/cas9技术构建akap12基因突变动物模型的方法，所述方法包括通过使用本发明第二方面的试剂盒构建得到。
21、在本发明一些实施方式中，所述方法包括：将所述cas9 mrna、所述含有突变位点的同源载体和所述sgrna的混合物导入至模型动物的受精卵中，获取成活的受精卵，移植至代孕母体中，繁育，获取子代并进行基因型鉴定筛选，筛选得到稳定遗传的纯合突变动物模型。
22、在本发明一些实施方式中，所述混合物中，所述cas9 mrna、所述含有突变位点的同源载体和所述sgrna的质量比为1:0.5～1.5:0.5～1.5；所述sgrna1和sgrna2的质量比为1：0.5～1.5。
23、在本发明一些实施方式中，所述混合物中，所述cas9 mrna、所述含有突变位点的同源载体和所述sgrna的终浓度均为100～300ng/μl。
24、在本发明一些实施方式中，所述导入的方式包括注射。
25、在本发明一些实施方式中，所述基因型鉴定筛选包括取子代动物的尾血，通过pcr扩增并测序。
26、在本发明一些优选实施方式中，所述pcr扩增中使用的引物包括rat akap12-f和rat akap12-r引物对，所述引物rat akap12-f的碱基序列如seq id no:4所示，所述引物rat akap12-r的碱基序列如seq id no:5所示。
27、在本发明一些优选实施方式中，所述测序过程中使用的测序引物的碱基序列seqid no:6所示。
28、在本发明一些实施方式中，将成活的受精卵移植至代孕母体中繁育得到子代命为f0代动物模型；将经过基因型鉴定筛选得到的阳性f0代动物模型与野生型进行交配，繁育获得f1代动物模型；将经过基因型鉴定筛选得到的f1代杂合子动物模型进行杂交，繁育得到f2代动物模型，经过基因型鉴定筛选得到阳性f2代纯合子动物模型，即akap12突变基因敲入动物模型。
29、在本发明一些实施方式中，所述动物模型为小鼠、大鼠、猴子中的一种。
30、在本发明一些优选实施方式中，所述动物模型为大鼠。
31、本发明的第五个方面，提供由本发明第四方面的akap12突变基因敲入动物模型的构建方法构建的kap12突变基因敲入动物模型在筛选预防和/或治疗自闭症疾病的药物或自闭症疾病的致病机制研究中的应用。
32、本发明的有益效果是：
33、本发明首次在自闭症患儿的基因组中发现akap12基因发生突变，其突变位点为c.1655-1659del。为此，基于该突变位点，本发明提供了一种特异性靶向akap12突变基因的sgrna，通过该sgrna可基于crispr/cas9基因编辑技术构建得到akap12突变基因(c.1655-1659del)敲入动物模型，此为首次构建成功akap12突变基因敲入大鼠；该动物模型敲入效率高、可控性高、重复性好、易于繁殖饲养，弥补了现有动物模型的不足，且更稳定、更加符合自闭症的临床特点；有助于自闭症疾病的致病机制的研究以及治疗自闭症疾病药物的研发，可为自闭症的相关研究提供新的研究方向，为自闭症的发病机制及干预研究提供了良好的基础，利用此动物模型，可以为自闭症相关疾病的相关研究提供更加深入的见解；具有良好的医学临床应用前景和广泛利用价值。
1.一种特异性靶向akap12突变基因的sgrna，所述sgrna的序列包括：
2.一种试剂盒，包括权利要求1所述的sgrna。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas9 mrna和/或含有突变位点的同源载体，所述突变位点为c.1655-1659del；优选地，所述含突变位点的同源载体的核苷酸序列如seq id no:3所示。
4.根据权利要求2～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增引物、测序引物；优选地，所述扩增引物包括seq id no:4和seq id no:5所示的引物对；优选地，所述测序引物的序列如seq id no:6所示。
5.权利要求1所述的sgrna或权利要求2～4任一项所述的试剂盒在构建akap12突变基因敲入动物模型中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述动物模型包括小鼠、大鼠、猴子。
7.一种构建akap12突变基因敲入动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括通过使用权利要求2～4任一项所述的试剂盒构建得到。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将所述cas9 mrna、同源载体和所述sgrna的混合物导入至模型动物的受精卵中，获取成活的受精卵，移植至代孕母体中，繁育，获取子代并进行基因型鉴定筛选，即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述cas9 mrna、同源载体和所述sgrna的质量比为1:0.5～1.5:0.5～1.5；优选地，所述grna1和sgrna2的质量比为1:0.5～1.5。
10.权利要求7～9任一项所述的方法构建的akap12突变基因敲入动物模型在筛选预防和/或治疗自闭症的药物或自闭症的致病机制研究中的应用。
