本发明属于医药，涉及光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒的合成及以及其在药物传递中的应用。
背景技术：
1、肝细胞癌(hcc)的高发病率和高致死率对人类健康构成了重大威胁。将化疗药物与光动力学疗法相结合，具有创伤性小、适用性好和可重复治疗优点，已成为癌症治疗领域的新兴策略。然而，目前传统化疗药物存在无法有效的避免网状巨噬细胞系统的吞噬以及靶向性低等缺点。而仿生外泌体膜包被技术可以通过涂覆有外泌体膜于纳米颗粒上不仅可以提升其生物相容性，并延长血液循环时间，在体内还能发挥天然的靶向作用被广泛应用于临床研究。
2、多西他赛(docetaxel，dtx)是临床上常用的一种抗肿瘤治疗的化疗药物，通过抑制肿瘤细胞的分裂和生长来达到治疗效果，在肝癌患者中显示出一定的疗效，特别是在晚期肝癌患者。但因其器官的非选择性，多西他赛具有以下的副作用包括疲乏、恶心、脱发、肝肾毒性、呕吐。多西他赛还有比较特殊的副反应就是水钠潴留和过敏，因此，改善多西他赛的靶向性对其临床用药具有重大意义。原卟啉(protoporphyrin ix,ppix)是一种内源性的光敏剂，具有安全性好、疗效显著的特点，但因其器官选择性差、脂溶性低等特点在临床治疗时具有诸多限制。值得注意的是，光动力学与化学治疗相结合已经成为一种特别新型的抗癌策略。这种多模式疗法可以克服单一化疗模式治疗的局限性，以实现对肿瘤的协同效应，超越单个疗法的加成，具有协同效果。然而，由于光敏剂和化疗药物通常都具有溶解性差、体内消除快、非特异性分布等缺点，并且，二者体内行为也具有明显差异，给药后很难实现在肿瘤部位的时空一致性，因此，光动-化疗联合疗法还需设计合适的药物递送系统，实现在体循环中靶向肿瘤细胞并在肿瘤部位快速特异性释放。
3、大量原发肿瘤和肿瘤细胞系中的活性氧(ros)都比正常细胞高，造成肿瘤的高氧化微环境，因此，可以基于肿瘤高氧化环境对药物进行衍生化，使其具有氧化敏感性。ros响应性基团一般含有硫、硼和蹄三种元素，常见的ros响应性基团有单硫键、通缩硫醇等，其中单硫键有更好的ros响应性。此外，肝癌患者的癌细胞与肥胖相关的脂肪细胞外泌体之间的交流显著增强，并且肥胖患者的脂肪细胞外泌体对于肝癌细胞具有靶向性治疗具有潜力。
4、综上，通过结构修饰设计并合成光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒来改善其不良性，对肝癌靶向递送和化疗与光动力学联合治疗具有深远意义。
技术实现思路
1、本发明所解决的技术问题是设计并合成一种光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，具有脂肪细胞外泌体的仿生外壳，使其能够在正常的生理环境下稳定存在，在静注后可以靶向到达肿瘤部位，并在肿瘤细胞内异常高氧化环境下实现肿瘤细胞内特异性释放母药，具有极佳的临床转化前景。
2、为了实现上述目的，本发明提供了如结构(i)所示的氧化-脂酶双敏感的多西他赛衍生物(dstg)和结构(ii)所示的具有良好的脂溶性的原卟啉衍生物(ppla)：并且制备了光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，流程图如图7所示：
3、
4、本发明提供的dstg合成方法，包括如下步骤：
5、
6、将1,3-二羟基丙酮与亚油酸溶于无水二氯甲烷中，加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edci)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，0℃条件下搅拌2h发生酯化反应得中间产物。将中间产物溶于四氢呋喃-苯(5:1)混合溶剂中，加入总体积1/10的超纯水，0℃条件下搅拌30min后，加入硼氢化钠固体粉末，室温条件下搅拌30min得到化合物1。
7、
8、在单硫代二丙酸中环滴乙酸酐，25℃条件下搅拌2h。反应结束后，将反应液通过旋蒸除去乙酸酐。加入无水二氯甲烷复溶，并加入化合物1和催化剂dmap升温至25℃于氮气保护条件下反应12h，反应结束后，将反应液旋干，用硅胶色谱法纯化得到化合物2。
9、
10、称取化合物2加入催化剂dmap和edci，在0℃条件下搅拌2h。反应结束后，将多西他赛加到上述反应液中，在室温条件下搅拌24h。反应结束后用硅胶色谱法纯化得到终产物，即化合物3。
11、本发明提供的ppla合成方法，包括如下步骤：
12、
13、将亚油酸用无水二氯甲烷溶解，加入催化剂edci和dmap，在0℃条件下搅拌2h。反应结束后，将乙二醇逐滴加入上述反应液中，升温至25℃搅拌12h。通过不断添加不同比例的流动相(石油醚和乙酸乙酯＝30:1-1:1，v/v)使粗产物中的杂质分离，流动相采用石油醚和乙酸乙酯体积比为30:1开始，采用薄层层析法检测产物分离情况，当流动相比例为2:1时收集此时硅胶柱流出的流动相，旋干到化合物1。
14、
15、将ppix用无水二氯甲烷溶解，加入催化剂edci和dmap，在0℃条件下反应2h。反应结束后，将化合物1用无水二氯溶解加入到上述反应液中，升温至25℃搅拌12h。反应结束后，通过不断添加不同比例的流动相(石油醚和乙酸乙酯＝20:1-1:1，v/v)使粗产物中的杂质分离，流动相采用石油醚和乙酸乙酯体积比为20:1开始，采用薄层层析法检测产物分离情况，当流动相比例为1.5:1时收集此时硅胶柱流出的流动相，旋干得到终产物ppla。
16、本发明提供的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
17、为了获得功能性脂肪细胞来源的外泌体，使用棕榈酸模拟肥胖条件的“鸡尾酒”分化方法，将3t3-l1小鼠前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞。诱导后，将旧培养基轻轻吸去，在有或无高脂条件下处理后用移液枪吸取上清液，转移至超滤管中，超速梯度离心得到的沉淀即为高脂的脂肪细胞外泌体(以下简称hem)和非高脂处理的脂肪细胞外泌体(以下简称nem)。通过共挤出法将多西他赛衍生物前药和原卟啉衍生物前药分别与hem或nem制备得到光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒(hemps和nemps)。原卟啉衍生物前药和多西他赛衍生物前药，按照质量比为10:1～1:10混合。
18、本发明所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
19、本发明所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备癌症靶向治疗药物的应用。
20、本发明所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
21、本发明的优势在于：①将多西他赛制备成了氧化敏感型的前药，降低了多西他赛的系统毒性，并能够实现在肿瘤部位特异性的释放母药，达到增效减毒的效果；②将光敏剂原卟啉修饰上不饱和脂肪酸链，改善了其脂溶性差的缺点；③通过脂肪细胞外泌体的伪装，增加了前药的靶向性，并能够实现在肿瘤部位智能释药；④利用该仿生外泌体的内核类脂滴纳米粒的单硫键结构与甘油三酯结构可在肿瘤部位的高氧化、高脂酶环境下发生氧化断裂，在外加激光照射激活后释药效率大大增加，实现药物在到达肿瘤部位后才释放出多西他赛母药，并且产生活性氧及脂质过氧化效应杀伤肿瘤细胞，达到抗肿瘤效果。为改善多西他赛在临床应用上的缺点及开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，具有较大的应用前景。
1.光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，其特征在于，所述纳米粒具有脂肪细胞外泌体的仿生外壳，使其在正常的生理环境下稳定存在，在静注后靶向到达肿瘤部位，并在肿瘤细胞内异常高氧化环境下实现肿瘤细胞内特异性释放母药；所述前药由原卟啉衍生物、多西他赛衍生物组成。
2.根据权利要求1所述的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，其特征在于，所述多西他赛衍生物，具有氧化-脂酶双重敏感特性，为如下所示化合物或其药学上可接受的盐；
3.根据权利要求2所述的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，其特征在于，所述多西他赛衍生物的制备方法，采用如下步骤制备：
4.根据权利要求1所述的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，其特征在于，所述原卟啉衍生物，具有良好的脂溶性，为如下所示化合物或其药学上可接受的盐；
5.根据权利要求4所述的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒，其特征在于，所述原卟啉衍生物的制备方法，采用如下步骤制备：
6.权利要求1所述的光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒的制备方法，其特征在于，将3t3-l1细胞接种于100mm3培养皿中，提取高脂的脂肪细胞外泌体和非高脂处理的脂肪细胞外泌体，称量原卟啉衍生物和多西他赛衍生物，按照质量比为1:1混合，用去离子水定容到2ml，得到前药共组装纳米粒；
7.权利要求1所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备药物传递系统中的应用。
8.权利要求1所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备癌症靶向治疗药物的应用。
9.权利要求1所述光化一体的脂肪细胞外泌体仿生前药纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
