本技术涉及生物，尤其是涉及一种小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型及其构建方法。
背景技术：
1、小细胞肺癌(sclc)约占所有肺癌的15％，具有生长迅速、早期转移及预后差的特征。尽管在临床中进行了积极的治疗，但大多数患者最终因获得性耐药而进展或复发。
2、目前通过监测外周血循环肿瘤细胞(ctc)的变化可以早期评估小细胞肺癌患者的预后情况，并动态监测小细胞肺癌患者对治疗的反应。目前预测的主流技术是cellsearch系统，基于上皮细胞粘附分子(epcam)富集ctc，并通过细胞角蛋白(ck)鉴定ctc，但是这种方法不但忽略了具有间充质表型的ctc，而且无法表征ctc的非整倍体状态。目前也有应用差相富集-免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交技术(se-ifish)来富集并鉴定ctc的倍体状态，但是在临床研究及应用中，大多数研究者将所有循环肿瘤细胞看为一个整体，用来预测预后及监测治疗效果；这种方法忽略了循环肿瘤细胞中不同倍体的异质性，构建的模型可能会失真，使得预测预后及监测治疗的模型的准确性较低。
技术实现思路
1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型及其构建方法。本技术通过不同循环肿瘤细胞(三倍体、四倍体、多倍体)不同的权重，最后获得了循环肿瘤细胞倍体评分acs，可以用来评估小细胞肺癌患者的预后情况，并动态监测小细胞肺癌患者疾病的状态，同时可以预测患者对化疗及免疫治疗的反应。本发明解决了实时监测治疗效果/预后评估的难题，更好地实现精准治疗。
2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
3、本技术提供了一种小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型的构建方法，包括以下步骤：
4、采用差相富集-免疫荧光染色结合染色体荧光原位杂交方法获得循环肿瘤细胞中不同倍体的状态，通过单因素及多因素cox分析，筛选得到预测小细胞肺癌预后及监测疗效的指标，并获得每个指标的相关系数，生成一个循环肿瘤细胞倍体评分acs；
5、循环肿瘤细胞倍体评分acs由各指标与cox回归系数加权求和：acs＝0.223*三倍体个数+0.444*四倍体个数+1.496*多倍体个数；根据acs划分高风险和低风险患者。
6、在本技术的技术方案中，使用se-ifish技术得到循环肿瘤细胞中不同倍体(三倍体、四倍体、多倍体)的状态后，通过单因素及多因素cox分析，筛选可用来预测预后的指标，并获得每个预测指标的相关系数，为每位患者生成一个循环肿瘤细胞倍体评分(acs)，acs由各预测指标与cox回归系数加权求和：acs＝0.223*三倍体个数+0.444*四倍体个数+1.496*多倍体个数；采用上述acs评分可以用来评估小细胞肺癌患者的预后情况，并动态监测小细胞肺癌患者疾病的状态，同时可以预测患者对化疗及免疫治疗的反应。
7、本技术采用的循环肿瘤细胞倍体评分acs充分的考虑到不同倍体在肿瘤生物学功能中的贡献，使预测预后及监测治疗的模型具有更高的准确性。
8、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，采用免疫荧光染色结合染色体荧光原位杂交方法鉴定循环肿瘤细胞中三倍体、四倍体及多倍体的个数。
9、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，所述循环肿瘤细胞来源于外周血。
10、其中，采用差相富集对循环肿瘤细胞进行富集，具体包括以下步骤：
11、1)使用5ml磷酸盐缓冲液稀释外周血样本，以600g离心5分钟，弃去血浆；
12、2)剩余沉淀使用加入5ml红细胞裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，室温10分钟(20转/分钟)，以400g离心5分钟，吸弃上清；
13、3)将150μl cd45抗体包被的免疫磁珠加入上述沉淀中，同时摇动离心管以充分混匀。调节水平摇床至100rpm，将离心管以40°角倾斜固定于摇床上，室温摇动20分钟；
14、4)将离心管置于磁力架上静置5分钟，将悬浮液体转移至1.5ml离心管，2070g离心3分钟，吸弃上清至约100ul；
15、5)加入100μl 10％的中性福尔马林固定液，充分吹打混匀10次以上，样本涂片(直径约2cm)至防脱载玻片上；
16、6)自然干燥。
17、本技术使用免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交鉴定循环肿瘤细胞中三倍体、四倍体及多倍体的个数，具体包括以下步骤：
18、1)将含有循环肿瘤细胞的玻片上置于75℃70％甲酰胺变性液中变性5分钟；
19、2)立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5分钟，室温晾干，接下来避光操作；
20、3)在玻片上滴10μl cep 8spectrumgreen探针，盖上盖玻片，注意避免气泡，使用石蜡封口膜封住盖玻片边缘；
21、4)将玻片置于statspin thermobrite仪器上进行杂交，设置程序：变性76℃5分钟，杂交37℃1.5小时；
22、5)取出玻片，小心撕去封口膜，注意切勿移动盖玻片，将玻片放入43℃50％甲酰胺工作液，小心甩去盖玻片后，轻摇洗涤5分钟，重复三次；
23、6)用0.2％ bsa洗样本区2次，加入200μl alexa fluor 594标记的单克隆抗cd45抗体工作液，室温下避光孵育1.5小时；
24、7)用0.2％ bsa洗标本区2次，吸净残留液体；
25、8)最后加10μl含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi)的封片剂，盖片；
26、9)在axio imager z2荧光显微镜，物镜40倍放大下进行观察：三倍体为dapi+、cd45-及cep8＝3，四倍体为dapi+、cd45-及cep8＝4，多倍体为dapi+、cd45-及cep8≥5。
27、10)统计每个患者5ml外周血中循环肿瘤细胞三倍体、四倍体及多倍体的个数。
28、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，所述三倍体为dapi+、cd45-及cep＝3，所述四倍体为dapi+、cd45-及cep8＝4，所述多倍体为dapi+、cd45-及cep8≥5。
29、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，将获得的循环肿瘤细胞中不同倍体纳入cox比例风险模型进行单因素分析，分析单因素对生存时间的影响，并将单因素分析中满足p＜0.1的因素纳入多因素分析。
30、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，所述多因素分析采用cox比例风险模型对2个或2个以上因素对生存时间的影响，得到p<0.05的独立预后因素，三倍体、四倍体及多倍体均是独立的预后因素。
31、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，所述循环肿瘤细胞倍体评分acs的截断值为1.115，将acs值大于等于1.115的划为高风险组，将acs值小于1.115的划为低风险组。
32、本技术通过特定的acs截断值(cut off)将患者分为高风险组(acs≥1.115)及低风险组(acs＜1.115)。
33、高风险组患者的无进展生存率低于低风险acs组，危险比(hr)为2.89，95％置信度下置信区间(ci)是1.68至4.98，p<0.001；高风险组患者的总生存率低于低风险组，危险比(hr)为7.96，95％置信度下置信区间(ci)是4.03至15.70，p<0.001。
34、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，采用r语言中survival包中的survfit()函数对患者的acs风险状态进行无进展生存率及总生存率分析。
35、作为本技术所述预测模型的构建方法的优选实施方式，采用循环肿瘤细胞倍体评分acs用于以下任一方面：
36、1)预测小细胞肺癌预后；
37、2)动态监测疾病状态；
38、3)预测化疗治疗效果；
39、4)指导免疫治疗。
40、本技术将患者治疗前(t0)、治疗期间及治疗后(t1、t2)和随访期间的外周血进行循环肿瘤细胞检测，对不同的时间点acs状态进行分析。与治疗前相比，pd患者的acs评分升高(p<0.001)，pr患者的acs与治疗前比较降低(p＝0.036)，而在sd患者组中acs评分没有显著变化。此外，对于随访pd的评估，acs比ct扫描更敏感，中位提前期为2.8个月(iqr，1.8-5.9个月)。
41、本技术分析只接受化疗的患者治疗前的外周血循环肿瘤细胞评分的状态与化疗效果的关系，治疗前低acs患者中46.6％(27/58)获得了客观缓解(orr)，而高acs患者只有4.3％(1/23)获得了客观缓解(p＝0.001)。
42、本技术还评估了acs预测患者接受化疗或化疗联合免疫治疗的反应的能力。当患者在治疗前acs为高风险时，使用化疗联合免疫治疗可比单独使用化疗的患者具有更长的pfs(中位pfs，7.7个月；hr＝0.34(95％ci，0.15-0.74)，p＝0.007)和os(中位os，16.3个月；hr＝0.44(95％ci，0.20-0.94)，p＝0.033)。
43、本技术采用上述构建方法制备的小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型，所述预测模型以三倍体、四倍体及多倍体的个数作为输入变量。
44、与现有技术相比，本技术具备以下有益效果：
45、本技术提供了一种小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型及其构建方法，使用se-ifish技术得到循环肿瘤细胞中不同倍体(三倍体、四倍体、多倍体)的状态后，通过单因素及多因素cox分析，筛选可用来预测预后的指标，并获得每个预测指标的相关系数，为每位患者生成一个循环肿瘤细胞倍体评分(acs)，acs由各预测指标与cox回归系数加权求和：acs＝0.223*三倍体个数+0.444*四倍体个数+1.496*多倍体个数；采用acs可以用来评估小细胞肺癌患者的预后情况，并动态监测小细胞肺癌患者疾病的状态，同时可以预测患者对化疗及免疫治疗的反应。
1.一种小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，采用免疫荧光染色结合染色体荧光原位杂交方法鉴定循环肿瘤细胞中三倍体、四倍体及多倍体的个数。
3.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞来源于外周血。
4.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，所述三倍体为dapi+、cd45-及cep＝3，所述四倍体为dapi+、cd45-及cep8＝4，所述多倍体为dapi+、cd45-及cep8≥5。
5.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，将获得的循环肿瘤细胞中不同倍体纳入cox比例风险模型进行单因素分析，分析单因素对生存时间的影响，并将单因素分析中满足p＜0.1的因素纳入多因素分析。
6.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，所述多因素分析采用cox比例风险模型对2个或2个以上因素对生存时间的影响，得到p<0.05的独立预后因素，三倍体、四倍体及多倍体均是独立的预后因素。
7.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞倍体评分acs的截断值为1.115，将acs值大于等于1.115的划为高风险组，将acs值小于1.115的划为低风险组。
8.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，采用r语言中survival包中的survfit()函数对患者的acs风险状态进行无进展生存率及总生存率分析。
9.如权利要求1所述的预测模型的构建方法，其特征在于，采用循环肿瘤细胞倍体评分acs用于以下任一方面：
10.如权利要求1～9任一项所述的构建方法制备的小细胞肺癌预后及监测疗效的预测模型，所述预测模型以三倍体、四倍体及多倍体的个数作为输入变量。
