1.本发明涉及通过培养生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸(pdc)的微生物来制备pdc的方法。
背景技术：2.木质素是植物的主要成分，其作为一种芳香族高分子化合物普遍存在于植物细胞壁中，是一种在树木中占30％，在水稻和玉米秆中占15％的生物质资源。此外，植物还含有其他各种芳香族化合物作为组成成分。但是，以木质素为主要成分的源自植物的芳香族成分，因由多种化学结构的成分构成，且具有复杂的高分子结构，而尚未开发出有效的利用技术。作为现有利用技术，有一种以木质素为主要成分的植物来源的芳香族成分通过碱分解等化学分解产生的低分子量芳香族分解产物中分离并制得作为香料原料的香草醛的实际应用技术。但是，对于化学分解产生的香草醛以外的大量低分子芳香族物质，目前还没有有效的利用方法。因此，在造纸过程中大量产生的木质素作为重油的替代品被燃烧而没有得到有效利用。
3.支撑如今的石油化工发展的原理，是先将作为多种化学成分混合物的原油通过催化分解和分馏转化为苯或乙烯等单一的中间物质，然后以它们为原料制备各种功能性塑料。这一支撑石油化工产业发展的基本原理是也可以适用于具有多种化学结构和复杂的高分子结构的木质素等植物芳香族成分的利用技术的普遍原理。
4.目前已发现，对木质素等植物芳香族成分通过水解、氧化分解、可溶性分解等化学分解方法，利用超临界水和超临界有机溶剂进行物理化学分解方法转化为包括香草醛、丁香醛、香草酸、丁香酸、原儿茶酸等的低分子混合物，并且这五种化合物被微生物鞘氨醇菌.syk-6(sphingobium sp.syk-6)完全降解和代谢成二氧化碳和水，在其代谢途径中，这五种化合物通过单一中间体2-吡喃酮-4,6-二羧酸降解(见图1)。
5.2-吡喃酮-4,6-二羧酸(以下简称pdc)与作为聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)树脂原料的对苯二甲酸(tpa)一样，分子中有两个羧基，是一种典型的缩聚材料，有望成为具有石油化学中前所未有的新性能的物质。
6.作为pdc的制造方法，报道了构成用于发酵生产pdc的多步反应过程的如下制造方法，即，使用携带编码四种酶(苯甲醛脱氢酶、去甲基化酶、原儿茶酸4,5-双加氧酶、4-羧基-2-羟基粘康酸-6-半醛脱氢酶)的基因的转化细胞，从上述五种化合物制备pdc的方法(例如专利文献1和非专利文献1)。
7.专利文献1中记载的方法公开了在1l发酵液中生成10～20g的pdc，非专利文献1中记载的方法公开了生产15g/l的pdc。但是，在这些收率下，即使得到高功能性高分子材料，最终产品价格高，因此产业竞争力低而尚未投入实际应用。
8.专利文献2公开了pdc的纯化方法，在该文献的方法中，通过在生成的pdc中形成金属离子(例如钠离子)和复合盐，来达到提高了纯化效率的目的。
9.专利文献3公开了一种用于制备pdc的重组载体和含有该重组载体的转化体的制
备方法。现有技术文献专利文献
10.专利文献1：日本专利特开2005-278549号公报专利文献2：日本专利特开2008-079603号公报专利文献3：日本专利特开2011-067139号公报。非专利文献
11.非专利文献1：otsuka et al.,journal of environmental biotechnology society,(2006),6(2):93-103。
技术实现要素：发明所要解决的技术问题
12.上述专利文献1和非专利文献1中，在溶解起始原料和调节ph值时使用氢氧化钠，作为培养基的成分也含有钠盐，这些钠离子与生成的pdc形成复合盐，虽然是不溶的，但本发明人已经对是否可以通过避免由于pdc的复合盐的形成而引起的不溶来提高pdc的生产效率进行了研究。
13.结果，本发明的目的在于，通过防止pdc和金属离子之间形成复合盐，从而确立了发酵产生pdc的微生物的高密度培养方法，并提供以更高产率制备pdc的方法。本发明还包含以更高的产率生产pdc的培养基的组分的研究。解决技术问题的技术方案
14.本发明人对现状进行了深入研究，结果发现了在pdc产生中使用不含碱金属的缓冲液作为溶解起始原料的缓冲液和调节ph值的缓冲液，从而防止了复合盐的形成，可以高密度培养微生物，因此可以高收率制备2-吡喃酮-4，6-二羧酸，从而完成了本发明。
15.此外，本发明人通过使用不含碱金属的主培养基作为用于培养微生物的培养基，成功地防止了复合盐的形成。
16.即，(1)本发明提供一种通过培养生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸(pdc)的微生物来制备2-吡喃酮-4,6-二羧酸的方法，其包括将用于生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的起始材料溶解在不含碱金属的缓冲液中的步骤，以及用不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤。
17.(2)本发明提供一种根据(1)所述的方法，其中，所述将用于生产pdc的起始原料溶解在不含碱金属的缓冲液的步骤包括，在含有溶解所述起始原料的不含碱金属的缓冲液的培养液中培养所述微生物的步骤，所述用不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤包括，在培养过程中ph值下降时，用适当的不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤。(3)本发明提供一种根据(1)或(2)所述的方法，其中，所述不含碱金属的缓冲液为铵类缓冲液。(4)本发明提供一种根据(3)所述的方法，其中，所述铵类缓冲液为铵水。(5)本发明提供一种根据(1)-(4)中任一项所述的方法，其中，还包括添加氨基酸混合物的步骤。
(6)本发明提供一种根据(5)所述的方法，其中，作为所述氨基酸混合物，使用酵母提取物。(7)本发明提供一种根据(6)所述的方法，其中，所述酵母提取物以3g/l以上的量添加到培养液中。(8)本发明提供一种根据(1)-(7)中任一项所述的方法，其中，还包括添加碳源的步骤。(9)本发明提供一种根据(8)所述的方法，其中，所述碳源为葡萄糖。(10)本发明提供一种根据(8)或(9)所述的方法，其中，所述添加为向下流动添加。(11)本发明提供一种根据(1)-(10)中任一项所述的方法，其中，还包括添加二价金属离子的步骤。(12)本发明提供一种根据(11)所述的方法，其中，所述二价金属离子为mgso4·
7h2o、feso4·
7h2o、mgo、caco3、znso4·
7h2o、mnso4·
4h2o、cuso4·
5h2o、coso4·
7h2o和h3bo3。(13)本发明提供一种根据(1)-(12)中任一项所述的方法，其中，包括向下流动添加起始材料的步骤。
18.(14)本发明提供一种根据(1)-(13)中任一项所述的方法，其中，所述微生物为含有重组载体的假单胞菌(pseudomonas)属细菌的转化体。(15)本发明提供一种根据(14)所述的方法，其中，所述假单胞菌是恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。(16)本发明提供一种根据(1)-(15)中任一项所述的方法，其中，所述起始原料为香草酸或香草醛，或含有香草醛和/或香草酸的芳香族物质的混合物。(17)本发明提供一种根据(1)-(16)中任一项所述的方法，其中，每单位用量(l)的培养液制备40g以上的pdc。(18)本发明提供一种根据(17)所述的方法，其中，每单位用量(l)的培养液制备80g以上的pdc。(19)本发明提供一种根据(18)所述的方法，其中，每单位用量(l)的培养液制备100g以上的pdc。发明效果
19.根据本发明，可以防止pdc与碱金属离子之间形成复合盐，高密度培养生产pdc的微生物，以低成本和高收率制备pdc。
附图说明
20.图1显示了鞘氨醇菌syk-6菌株的低分子量木质素代谢途径和代谢酶基因。图2显示了由香草酸生产pdc(1)时，各值的经时变化。图3显示了由香草酸生产pdc(1)时的tlc结果。图4显示了由香草酸生产pdc(2)时，各值的经时变化。图5显示了由香草酸生产pdc(2)时的tlc结果。图6显示了由香草醛生产pdc时，各值的经时的变化。图7显示了由香草醛生产pdc时的tlc结果。
具体实施方式
21.本发明提供了一种通过培养生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸(pdc)的微生物来制备pdc的方法，其包括：将用于生产pdc的起始材料溶解在不含碱金属的缓冲液中，并用不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤。
22.本发明的方法通过在培养过程中使用不含碱金属的缓冲液来防止pdc复合盐的形成，并且能够实现微生物的高密度培养(高pdc生产)。
23.后续将详细描述本发明中使用的香草酸和香草醛等起始原料。这些起始材料优选溶解在缓冲液中并以溶液的形式添加到培养液中。本发明人在以往的研究中得到，将粉末状的香草醛添加到培养液，出现香草醛残留，并香草酸蓄积的现象，几乎不产生pdc的结论。这认为是由于添加香草醛粉末后立即观察到溶解氧的快速增加，因此添加香草醛粉末对微生物的生长有不利影响。
24.培养液的ph值应调整到适合于微生物生长的范围，例如，需要调整到ph4.0至10.0的范围。由于pdc具有两个羧基，因此培养液的ph值会随着pdc的产生而降低。为了防止因ph值降低导致抑制微生物的生长，并维持适当的ph值，需要用适当的缓冲液调节培养液的ph值。培养液的ph值优选控制在6.0以上，更优选控制在6.5-7.5的范围内。ph值控制例如可以通过使用培养装置所具备的控制功能，根据培养液ph值的变动自动添加缓冲液来实现。
25.本发明中用于溶解起始原料和调节ph值的缓冲溶液使用不含钠等碱金属的缓冲溶液。另外，优选培养基成分中尽量不含有碱金属，优选主培养基不含碱金属。如上所述，这是为了防止pdc和碱金属之间形成复合盐，例如，以香草酸为起始原料，使用naoh对其进行中和溶解和ph值调节，且主培养基中含有na2hpo4时，本发明人发现，当添加到培养液中的香草酸的量超过20g时，在培养液中发生沉淀，之后培养基中不再蓄积pdc。该沉淀物提示，生成的pdc与na形成复合盐，且不溶解。此外，已知当在相同条件下仅在调节ph值时使用氨水时，在发酵完成后纯化pdc的过程中，用hcl调整培养液上清至ph1，会形成被认为具有不溶性的pdc-na盐的沉淀物。因此，本发明中的“不含碱金属的缓冲液”意味着该缓冲液不含形成pdc复合盐程度的碱金属。
26.本发明使用的不含碱金属的缓冲液包括但不限于铵盐、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲基甘氨酸(tricine)等，其中优选铵类缓冲剂，特别优选氨水。
27.培养液的溶解氧(do)，对于培养的微生物来说，需要维持适当的溶解氧饱和度。优选地，控制搅拌使得do≥15％饱和。溶解氧可以通过培养装置所具有的控制功能进行监测和控制。已观察到溶解氧浓度在微生物的对数生长期期间由于消耗诸如葡萄糖等碳源而降低，之后当培养基中的葡萄糖耗尽时增加。
28.培养液的温度控制在促进微生物生长和pdc生成的温度。培养液的温度控制在20-40℃，优选控制在25-30℃的范围内，更优选控制在28℃。
29.上述培养时的ph值调节、溶解氧测定、通气、搅拌速度调节及温度调节等可以通过使用具有这些功能的培养槽来实现。
30.用于培养微生物的培养基或培养液需要添加碳源、氮源、无机营养源等，用于作为微生物的生长和/或生产pdc的营养源。
31.本说明书中的“培养基”包括预培养基和主培养基。本说明书中，“预培养基”是指在不添加起始材料的情况下小规模培养微生物的培养基，“主培养基”是指在预培养基中添
加使微生物生长的预培养液并添加起始原料的培养基，是通过微生物进行pdc生产的培养基。
32.在本发明中，作为氮源，主要使用有机氮源的氨基酸混合物。本发明中使用的氨基酸混合物包括酵母提取物、麦芽提取物、肉提取物等，特别优选酵母提取物。
33.可以将氨基酸混合物添加到预培养基和主培养基中。优选地，氨基酸混合物可以以3g/l以上的量添加到主培养基中。优选地，氨基酸混合物可以以4g/l以上、5g/l以上、6g/l以上的量添加到主培养基中、更优选可以以6.44g/l以上的量添加到主培养基中。优选地，氨基酸混合物可以以3-7g/l的量添加到主培养基中。
34.为了微生物生长并生产足够量的pdc，需要碳源。本发明中所使用的碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等，特别优选葡萄糖。
35.优选地，碳源以向下流动添加的方式添加到培养基中。本说明书中，“向下流动添加”是指例如使用蠕动泵等的连续添加的添加方式。
36.碳源优选在主培养基的制备时添加的碳源随着微生物的培养而耗尽的时候添加。对数生长期，微生物积极利用碳源和氧气来生长和增殖，当碳源耗尽时，耗氧量也会减少，从而增加培养物中的溶解氧。因此，碳源的耗尽可以通过溶解氧的增加来确认。因此，优选在培养开始后，在主培养基中的碳源耗尽而溶解氧增加时，向培养液中添加碳源。
37.微生物生长也需要无机营养源。例如，钾、钙、镁都作为糖酵解系统和tca循环中酶促反应的活化剂，是必须的。铁在好氧生物中呼吸链酶细胞色素中负责电子的传递。此外，还需要钴、铜、锌等微量元素。
38.本发明使用二价金属离子作为无机营养源。用于本发明的二价金属离子包括如镁、钙、铁(ii)、铜(ii)、锌、钡、钴、镍、锰、铬(ii)、硼等金属离子。二价金属离子可以以盐的形式添加，作为二价金属离子的盐，可例举该金属离子的盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐和磷酸盐等无机酸盐；乙酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氰酸和硫氰酸等有机酸盐等。优选地，作为二价金属离子，添加七水硫酸镁、七水硫酸铁、氧化镁、碳酸钙、七水硫酸锌、四水硫酸锰、五水硫酸铜、七水硫酸钴和硼酸。
39.可以将二价金属离子添加到预培养基和主培养基中。优选地，1l的主培养基中可以添加750mg的mgso4·
7h2o、71.25mg的feso4·
7h2o、80.625mg的mgo、15mg的caco3、10.8mg的znso4·
7h2o、8.4mg的mnso4·
4h2o、1.875mg的cuso4·
5h2o、2.1mg的coso4·
7h2o、0.45mg的h3bo3。
40.添加到培养基中的上述营养源的量、添加方法、添加时机等可以基于代谢物组分析的结果来确定。
41.本发明中使用的微生物只要是生产pdc的微生物就没有特别限定，优选为含有重组载体的假单胞菌(pseudomonas)属细菌的转化体，更优选为含有重组载体的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的转化体。
42.本发明中使用的载体优选为pdvz21x或pktvpvabc。制备这些载体的方法公开于例如日本专利特开2011-067139号公报，该文献中的载体pvapoligvabc与上述载体pktvpvabc相同。
43.本发明中使用的恶臭假单胞菌可以是恶臭假单胞菌ppy1100菌株。
44.本发明方法中使用的起始原料例如来源于植物成分或石油成分或化学合成的香
草醛、香草酸、丁香醛、丁香酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛等，优选香草酸或香草醛，或含有香草醛和/或香草酸的芳香族物质的混合物，特别优选香草酸或香草醛。
45.将起始材料溶于实质上不含碱金属的缓冲液中。如上所述，不含碱金属是指缓冲液中不含能够形成pdc复合盐的程度的碱金属。且，优选将起始材料以向下流动添加的方式添加到培养液中。
46.根据本发明的方法，可以高收率地制备pdc。例如，根据本发明的方法，每单位用量(l)的培养液制备30g以上、50g以上、60g以上、70g以上、80g以上、90g以上、110g以上、或120g以上的pdc。优选地，每单位用量(l)培养液制备40g以上、80g以上、或100g以上的pdc。此外，根据本发明的方法，每单位用量(l)培养液制备30-130g、40-130g、30-50g、70-130g、80-130g的pdc。在本发明的方法中，优选pdc的高收率，只要不对微生物的生长产生不良影响，可以大量生产。
47.微生物的培养时间没有特别限定，只要是微生物充分生长、且产生pdc所需的时间即可，例如，可以培养30小时以上、40小时以上、60小时以上、80小时以上、100小时以上。优选地，培养时间可以是60-100小时。
48.培养过程中使用不含碱金属的缓冲液也有利于产生的pdc的纯化过程。培养结束时，为了停止反应，用盐酸将培养液的ph值调整至1以下，这时，使用含有氢氧化钠等碱金属的缓冲液的培养液中，生成不溶性复合盐(钠盐)，培养液变的混浊。一旦发生盐的形成，除非使用强阳离子交换色谱等手段，无法分离和纯化pdc。而，在使用不含碱金属的缓冲溶液的本技术的方法中，即使盐酸处理后也不会发生盐的形成，可以通过例如乙酸乙酯萃取等简单的手段也能分离pdc。
49.实施例下面通过实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
50.下文所述使用恶臭假单胞菌(pdvz21x/ppy1100)和恶臭假单胞菌(pktvpvabc/ppy1100)的菌株是指分别含有载体pdvz21x和pktvpvabc的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)ppy1100菌株的转化体，这些载体和转化体按照日本专利特开2011-067139号公报中记载的制备方法制备。
51.实施例1：由香草酸制备pdc(1)i-1使用的菌株将恶臭假单胞菌(pdvz21x/ppy1100)在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基(10ml)中培养过夜，然后与等量的60％甘油溶液混合。将其注入各1.5ml并在-80℃中储存。将其作为工作细胞库(wcb)，用于本实验。
52.i-2培养基原料、试剂培养基原料和试剂使用通过以下来源获得的物质。
53.i-3培养条件(2l的培养槽)i-3-1使用仪器培养使用以下仪器。2l培养槽：mdl-2日本丸菱株式会社。振荡培养箱：br-30lf日本taitec株式会社(用于预培养；500ml的有挡板烧瓶)。
54.i-3-2预培养(1)预培养基的制备先制备如下溶液与培养基。[1]sss溶液的组成：每100ml。
[2]w.stock sol.ii的组成：每1l。mgso4·
7h2o
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10gfeso4·
7h2o
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0.5g将上述成分溶解于900ml去离子水中，加入[1]中所述的sss溶液100ml，用0.2mm过滤器过滤灭菌。[3]预培养的基础培养基
[0055]
使用上述溶液和培养基，如下制备预培养基。《每1l预培养基(改良w培养基)》将[3]中所述的预培养基础培养基89ml置于500ml的有挡板烧瓶中，高压灭菌。冷却后加入以下3种溶液。18g/100ml葡萄糖溶液10ml(在121℃灭菌20分钟)。10mg/ml硫酸卡那霉素溶液0.25ml(用0.2μm的过滤器过滤)。1ml的[2]中所述的w.stock sol.ii。
[0056]
(2)预培养条件将1ml的wcb甘油原液接种到装有预培养基的有挡板烧瓶中。然后，将其在28℃和150-160rpm/min下振荡培养8-11小时作为预培养液。
[0057]
i-3-3主培养(1)主培养基的制备首先，制备如下溶液和培养基。
[1]50％葡萄糖溶液。将150g葡萄糖溶于150g水中，121℃灭菌20分钟。[2]w.stock sol.ii(主培养用)的组成：每1l。mgso4·
7h2o
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25gfeso4·
7h2o
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1.25gsss溶液(参考上述i-3-2[1])
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250ml[3]主培养的基础培养基溶于自来水(0.95l)。[4]流动添加用香草酸溶液将100g香草酸悬浮于443g水中，滴加28％氨水(ph7-7.5)(28％氨水40-45ml)使其溶解。然后用0.2μm过滤器灭菌。
[0058]
使用上述溶液和培养基，如下制备主培养基。《每1l主培养的培养基(改良w培养基)》将[3]中所述的主培养的基础培养基置于培养槽中，加入0.22g的消泡剂adecanol lg295s。121℃灭菌20分钟，冷却后加入以下两种溶液。[1]中所述的葡萄糖溶液68g[2]中所述的w.stock sol.ii(用于主培养)(用0.2μm的过滤器过滤)15ml
[0059]
(2)主培养条件1)将0.4l主培养基置于2l培养槽中，接种0.05％(od660nm＝5)的预培养液。2)然后在28℃、200-800rpm、溶解氧(do)≥15％饱和条件搅拌并控制、1v.v.m.的通气量下培养。3)该培养液中自动加入14％氨水，以维持ph值在6.5以上。4)在加入到主培养基中的葡萄糖消耗并且溶解氧增加后(从培养开始约2小时后)，开始以0.08g/分的速度向培养液中向下流动添加50％葡萄糖溶液。5)同时，开始以0.11-0.17g/分的速度向下流动添加[4]中所述的香草酸溶液。6)在发泡过程中(培养20-40小时)，间歇性添加消泡剂。7)随时采样并测量细菌浓度(od660nm)。8)反应完成后，将hcl添加到已通过离心去除细菌的培养液中使其酸化(ph值约为1)，用乙酸乙酯萃取后，通过tlc确认香草酸的转化。9)进而，用甲醇(1/10-200)稀释培养液，对上清液通过hplc测定pdc的生成量。
[0060]
i-4结果培养开始73小时后，生成的pdc浓度达到110g/l。香草酸和葡萄糖的残留在培养80小时前后开始，培养99小时后，流动添加的香草酸的量达到140g，产生的pdc为123g/l，但此
后pdc浓度下降，反应几乎停止。图2显示了在培养过程中测量的每个值的经时变化，图3显示了培养73小时和培养145小时的tlc结果。
[0061]
实施例2：由香草酸制备pdc(2)除了变更上述“i-3-3主培养”中的以下点，其余与上面i中相同的方法生成pdc：
·
添加到主培养的基础培养基中的细菌酵母提取物的量从3.22g增加到6.44g；
·
添加到主培养基中的w.stock sol.ii(用于主培养)的量从15ml增加到30ml；
·
在“(2)主培养条件”的步骤1)中，放入2l培养槽的主培养基的量从0.4l改为0.5l。
[0062]
ii-4结果培养85小时后，100g香草酸完全转化，pdc的生成量为80g/l。图4显示了培养过程中测量的每个值的经时变化，图5显示了tlc的结果。
[0063]
实施例3：由香草醛制备pdciii-1使用的菌株将恶臭假单胞菌(pktvpvabc/ppy1100)在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基(10ml)中用烧瓶培养过夜，然后与等量的60％甘油溶液混合。将其注入各1.5ml并在-80℃中储存。将其用作本研究的wcb。iii-2
·
培养基原料、试剂香草醛
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(和光(wako))
※
其余与上述i相同。iii-3培养条件(2l的培养槽)iii-3-1使用仪器与上述i相同。iii-3-2预培养与上述i相同。
[0064]
iii-3-3主培养(1)主培养的培养基的制备首先，制备以下溶液和培养基。[1]50％葡萄糖溶液将150g葡萄糖溶于150g水中，121℃灭菌2分钟。[2]w.stock sol.ii(主培养用)的组成：每1lmgso4·
7h2o
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25gfeso4·
7h2o
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1.25gsss溶液(参考上述i-3-2[1])
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250ml[3]主培养的基础培养基
溶于自来水(0.95l)。[4]流动添加用香草醛溶液将50g香草醛悬浮于500g水中，滴加28％氨水(ph7.5-8.2)(28％氨水20-25ml)使其溶解。然后用0.2μm过滤器灭菌。[5]添加用酵母提取液将13g酵母提取物溶于94g水中，121℃灭菌20分钟。
[0065]
使用上述溶液和培养基，如下制备主培养基。《每1l主培养的培养基(改良w培养基)》将[3]中所述的主培养的基础培养基置于培养槽，加入0.22g的消泡剂adecanol lg295s。121℃灭菌20分钟，冷却后加入以下两种溶液。[1]中所述的50％葡萄糖溶液68g[2]中所述的w.stock sol.ii(用0.2μm的过滤器过滤)15ml
[0066]
(2)主培养条件1)将0.6l主培养基置于2l培养槽中，接种2％(od660nm＝10)的预培养液。2)然后在28℃、200-800rpm(do≥15％饱和的搅拌控制)，1v.v.m.的通气量下培养。3)该培养基中自动加入14％氨水，以控制ph值在6.5。4)在加入到主培养基中的葡萄糖消耗后(do增加)，开始向培养液中向下流动添加(以0.10g/分)葡萄糖溶液。5)同时，开始向下流动添加[4]中所述的香草醛溶液(以0.12-0.14g/l/分的速度)。6)在31小时和81小时加入10ml的[5]的酵母提取液+6ml w.stock sol.ii(用于主培养)。7)在发泡过程中(培养20-70小时)，间歇性加入消泡剂。8)随时采样并测量细菌浓度(od660nm)。9)反应完成后，将培养液的ph调至酸性(ph约为1)，用乙酸乙酯萃取后，通过tlc确认香草醛的转化。10)进而，用甲醇(1/10-200)稀释培养液，对上清液通过hplc测定pdc的生成量。
[0060]
i-4结果培养80小时后，pdc的生成量为40g/l。
技术特征：1.一种通过培养生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的微生物来制备2-吡喃酮-4,6-二羧酸的方法，其特征在于，包括将用于生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的起始材料溶解在不含碱金属的缓冲液中的步骤，以及用不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将用于生产2-吡喃酮-4,6-二羧酸的起始原料溶解在不含碱金属的缓冲液中的步骤包括，在含有溶解有所述起始原料的不含碱金属的缓冲液的培养液中培养所述微生物的步骤，所述用不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤包括，在培养过程中ph值下降时，用适当的不含碱金属的缓冲液调节培养液的ph值的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不含碱金属的缓冲液为铵类缓冲液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铵类缓冲液为铵水。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括添加氨基酸混合物的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用酵母提取物作为所述氨基酸混合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母提取物以3g/l以上的量添加到培养液中。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，还包括添加碳源的步骤。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述添加为向下流动添加。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，还包括添加二价金属离子的步骤。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述二价金属离子为mgso4·
7h2o、feso4·
7h2o、mgo、caco3、znso4·
7h2o、mnso4·
4h2o、cuso4·
5h2o、coso4·
7h2o和h3bo3。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，包括向下流动添加起始材料的步骤。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为含有重组载体的假单胞菌属细菌的转化体。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌是恶臭假单胞菌。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述起始原料为香草酸或香草醛，或含有香草醛和/或香草酸的芳香族物质的混合物。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，每单位用量(l)的培养液制备40g以上的2-吡喃酮-4,6-二羧酸。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，每单位用量(l)的培养液生产80g以上的2-吡喃酮-4,6-二羧酸。19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，每单位用量(l)的培养液生产100g以上的2-吡喃酮-4,6-二羧酸。
技术总结本发明的课题在于提供一种通过培养产生2-吡喃酮-4,6-二羧酸(PDC)的微生物来制备PDC的方法。本发明提供一种通过培养产生2-吡喃酮-4,6-二羧酸(PDC)的微生物来生产PDC的方法，其包括：将用于生产PDC的起始材料溶解在不含碱金属的缓冲液中，并用不含碱金属的缓冲液调节培养液的pH值的步骤。调节培养液的pH值的步骤。调节培养液的pH值的步骤。
技术研发人员：中村雅哉 大塚祐一郎 龟山敏治 龟山昂晖 政井英司 上村直史 片山义博
受保护的技术使用者：环泰克斯株式会社 国立大学法人长冈技术科学大学
技术研发日：2021.03.12
技术公布日：2022/11/1
