本发明属于血浆蛋白质谱分析，涉及一种血浆中蛋白的质谱检测前处理方法。
背景技术：
1、外周血中的分子标志物检测是对疾病诊断、疗效观察以及预后判断的重要依据。比如，病原体的核酸检测、甲胎蛋白与白介素-6等肿瘤类标志物与炎症因子等指标检测，是临床对感染、肿瘤、炎症等疾病的主要实验室诊断线索。随着医学的发展，这些传统指标已不能满足对疾病的精准诊断要求，也不利于新疾病的发现。因此，发现新的分子标志物是临床实验室研究中的重要任务。
2、利用质谱技术对血清或血浆中的蛋白进行全面检测(蛋白组学分析)，是发现疾病在外周血中蛋白类标志物的重要方法之一，也是目前国际领域内的重要研究方向，然而普遍存在着因检测深度不足，导致检测蛋白数目不够的技术瓶颈。这是因为，临床上与疾病相关的蛋白类标志物，如内分泌激素、肿瘤标志物、细胞因子、炎症介质等蛋白在外周血中含量很低，一般在ng～pg/ml水平范围内，而血清/血浆中的白蛋白、球蛋白、凝血因子、补体等的水平却非常高，一般在mg/ml水平上下，几乎是常见疾病标志物的百万倍及十亿倍以上。这些高丰度蛋白会使低丰度蛋白的被检测机会大大减少，严重干扰了这些疾病相关蛋白的检测。因此提高质谱对血清/血浆检测的深度，以增加低丰度蛋白的被检测机会，是国际领域内共同面临的重要问题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种血浆中蛋白的质谱检测前处理方法及处理试剂盒。
2、发明目的：本发明旨在增加人体血浆的蛋白检测数目，主要通过聚乙二醇及汽巴蓝对血浆样品中的高丰度蛋白进行分离，以极大提高发现临床疾病标志物的可能性。在血浆样品中加入聚乙二醇6000(peg6000)，血浆中的球蛋白、脂蛋白、补体等部分高丰度蛋白被沉淀。将沉淀后的血浆上清，利用汽巴蓝(cibacron blue 3g-a)凝胶柱对其进行过滤，血浆上清样品中的白蛋白会被吸附在凝胶柱上。经过这两步处理，血浆样品中的主要高丰度蛋白被大部分去除，然后利用碱性ph条件下通过反式液相层析(reverse phase liquidchromatography,rplc)对沉淀、去除白蛋白的滤过液、血浆等各样品进行层析分馏，最后利用液相色谱-质谱联用仪进行质谱检测蛋白，提高血浆样品的蛋白检测数量。
3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
4、本发明公开了一种血浆中蛋白的质谱检测前处理方法，包括如下步骤：
5、(1)聚乙二醇沉淀血浆、去白蛋白：将血浆样本与表面活性剂混合，再加入聚乙二醇沉淀血浆得到第一混合液；将所述的第一混合液离心，得到沉淀a和上清a；取部分所述的上清a经白蛋白去除离心小柱离心去除白蛋白，得到上清滤过液a；另取部分所述的上清a继续加入聚乙二醇沉淀血浆得到第二混合液；所述的第二混合液离心，得到沉淀b和上清b；将所述的上清b经白蛋白去除离心小柱离心去除白蛋白，得到上清滤过液b；
6、(2)样品沉淀：将血浆样本与无水乙腈混合进行沉淀，收集沉淀c；将所述的上清滤过液a和所述的上清滤过液b分别加入三氯乙酸进行沉淀，分别离心，分别洗涤沉淀，再分别离心得到沉淀d和沉淀e；
7、(3)蛋白酶解、还原烷基化：将所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别依次进行蛋白酶解处理、蛋白还原处理、蛋白烷基化处理、猝灭反应处理，得到肽段样品；
8、(4)肽段脱盐：将步骤(3)得到的肽段样品上样至脱盐柱中，使用脱盐清洗液进行脱盐洗涤，随后再加入脱盐洗脱液进行洗脱，收集含有肽段的洗脱液，经干燥得到脱盐的肽段；
9、(5)碱性条件进行反式液相层析分馏：将步骤(4)得到的脱盐的肽段通过反式液相层析进行层析分馏，收集得到的各肽段馏分进行干燥；
10、(6)质谱检测及蛋白鉴定：将步骤(5)分馏收集得到的肽段样品进样液相色谱-质谱联用仪中进行质谱检测；使用蛋白数据库分析质谱原始数据。
11、其中，上述血浆中蛋白的质谱检测前处理方法的操作步骤可参见图10。
12、在一些实施例中，步骤(1)中，所述白蛋白去除离心小柱为汽巴蓝琼脂糖凝胶柱；所述血浆为人血浆或动物血浆；所述表面活性剂为5％～10％ triton x-100；所述血浆样本与表面活性剂的体积比为9：1；所述聚乙二醇以溶液的形式存在，聚乙二醇溶液中溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液；所述血浆样本与表面活性剂混合得到的混合液与peg6000浓度为18～22％g/ml的聚乙二醇溶液混合，得到含有peg6000浓度为8～12％g/ml的第一混合液；所述另取部分所述的上清a继续加入peg6000浓度为30％g/ml的聚乙二醇溶液沉淀血浆，得到含有peg6000浓度为20％g/ml的第二混合液。
13、在一些实施例中，优选地，步骤(1)中，所述白蛋白去除离心小柱为汽巴蓝琼脂糖凝胶柱；所述血浆为人血浆或动物血浆；所述表面活性剂为10％ triton x-100；所述血浆样本与表面活性剂的体积比为9：1；所述聚乙二醇以溶液的形式存在，聚乙二醇溶液中溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.4的pbs缓冲液；所述血浆样本与表面活性剂混合得到的混合液与peg6000浓度为20％g/ml的聚乙二醇溶液混合，得到含有peg6000浓度为10％g/ml的第一混合液；所述另取部分所述的上清a继续加入peg6000浓度为30％g/ml的聚乙二醇溶液沉淀血浆，得到含有peg6000浓度为20％g/ml的第二混合液。
14、在一些实施例中，进一步优选地，步骤(1)中，所述白蛋白去除离心小柱为cibacron blue 3g-a琼脂糖凝胶柱；
15、其中，步骤(1)中，第一混合液在室温下混匀10min后，20,000g离心5分钟，得到沉淀a和上清a；取部分所述的上清a上样至白蛋白去除离心小柱中，在室温下旋转混匀15分钟，1000g离心1min去白蛋白，得到上清滤过液a；另取部分所述的上清a并继续加入聚乙二醇沉淀血浆，得到第二混合液；第二混合液在20,000g离心5分钟，得到上清b和沉淀b；将上清b上样至白蛋白去除离心小柱中，在室温下旋转混匀15分钟，1000g离心1min去白蛋白，得到上清滤过液b。
16、在一些实施例中，步骤(2)中，所述血浆样本与无水乙腈的体积比为1：9；所述上清滤过液a与三氯乙酸的体积比为9：1；所述上清滤过液b与三氯乙酸的体积比为9：1；所述洗涤使用无水乙腈洗涤。
17、其中，步骤(2)中，所述沉淀d用无水乙腈洗涤，重复洗涤3～5次，无水乙腈的单次用量无特殊限制，优选为所述上清滤过液a体积的2.5倍；所述沉淀e用无水乙腈洗涤，重复洗涤3-5次，无水乙腈的单次用量无特殊限制，优选为所述上清滤过液b体积的2.5倍。
18、在一些实施例中，步骤(3)中，将所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别用含有lys-c酶的尿素溶液溶解，沉淀溶解后加入缓冲液和胰蛋白酶进行酶解；酶解结束后向各样品酶解液中加入二硫苏糖醇进行还原反应，反应结束后加入碘乙酰胺进行烷基化反应，反应结束后再加入二硫苏糖醇进行猝灭反应，得到肽段样品。
19、在一些实施例中，步骤(3)中，所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液，尿素的浓度为8mol/l；所述含有lys-c酶的尿素溶液中，lys-c酶的浓度为0.020～0.030μg/μl；所述lys-c酶的用量，以各酶解样本起始所需血浆样本计，所述lys-c酶与所述血浆样本的质量体积比为1μg：9μl；所述缓冲液为teab缓冲液，25-50mm，ph＝8.4～8.6；所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别用含有lys-c酶的尿素溶液溶解，沉淀溶解后加入缓冲液，缓冲液的用量为将体系中的尿素稀释至终浓度为2mol/l；所述胰蛋白酶与所述lys-c酶的质量比为1：1；所述酶解，在室温下酶解12-24小时；所述二硫苏糖醇以水溶液的形式存在，二硫苏糖醇与水混合得到二硫苏糖醇水溶液；所述二硫苏糖醇水溶液与酶解液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为2mmol/l；所述还原反应，反应温度为室温，反应时间为0.75～1.25h；所述碘乙酰胺以水溶液的形式存在，碘乙酰胺与水混合得到碘乙酰胺水溶液；所述碘乙酰胺水溶液与所述还原反应结束后得到的反应液混合后的体系中，碘乙酰胺的终浓度为5mmol/l；所述烷基化反应，反应温度为室温，反应时间为0.5h；所述二硫苏糖醇水溶液与所述烷基化反应结束后得到的反应液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为5mmol/l；所述猝灭反应，反应温度为室温，反应时间为15min。
20、在一些实施例中，步骤(3)中，所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为50mm、ph＝8.5的teab缓冲液，尿素的浓度为8mol/l；所述含有lys-c酶的尿素溶液中，lys-c酶的浓度为0.025μg/μl；所述lys-c酶的用量，以各酶解样本起始所需血浆样本计，所述lys-c酶与所述血浆样本的质量体积比为1μg：9μl；所述缓冲液为teab缓冲液，50mm，ph＝8.5；所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别用含有lys-c酶的尿素溶液溶解，沉淀溶解后加入缓冲液，缓冲液的用量为将体系中的尿素稀释至终浓度为2mol/l；所述胰蛋白酶与所述lys-c酶的质量比为1：1；所述酶解，在室温下酶解12-24小时；所述二硫苏糖醇以水溶液的形式存在，二硫苏糖醇与水混合得到二硫苏糖醇水溶液；所述二硫苏糖醇水溶液与酶解液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为2mmol/l；所述还原反应，反应温度为室温，反应时间为1h；所述碘乙酰胺以水溶液的形式存在，碘乙酰胺与水混合得到碘乙酰胺水溶液；所述碘乙酰胺水溶液与所述还原反应结束后得到的反应液混合后的体系中，碘乙酰胺的终浓度为5mmol/l；所述烷基化反应，反应温度为室温，反应时间为0.5h；所述二硫苏糖醇水溶液与所述烷基化反应结束后得到的反应液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为5mmol/l；所述猝灭反应，反应温度为室温，反应时间为15min。
21、其中，所述二硫苏糖醇水溶液中二硫苏糖醇的浓度无特殊限制，优选为1mol/l；所述碘乙酰胺水溶液中碘乙酰胺的浓度无特殊限制，优选为0.1mol/l。
22、其中，所述teab缓冲液为triethylammonium bicarbonate，三乙胺-碳酸氢盐缓冲液。
23、在一些实施例中，步骤(4)中，所述脱盐柱为c18脱盐柱；所述脱盐清洗液为0.1vt％甲酸水溶液；所述脱盐洗脱液为含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液；
24、所述肽段脱盐按照如下步骤进行：
25、将步骤(3)得到的肽段样品与8～12vt％三氟乙酸水溶液混合后上样至脱盐柱中，使用0.1vt％甲酸水溶液进行脱盐洗涤，随后再加入含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液进行洗脱，收集含有肽段的洗脱液，经干燥得到脱盐的肽段；
26、其中，所述肽段样品与所述8～12vt％三氟乙酸水溶液的体积比为9：1；优选地，将步骤(3)得到的肽段样品与10vt％三氟乙酸水溶液混合后上样至脱盐柱中，使用0.1vt％甲酸水溶液进行脱盐洗涤，随后再加入含有0.1vt％甲酸的65vt％乙腈水溶液进行洗脱，收集含有肽段的洗脱液，经干燥得到脱盐的肽段。
27、在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，所述肽段样品与所述10vt％三氟乙酸水溶液的体积比为9：1。
28、其中，步骤(4)中，所述的脱盐柱为c18脱盐柱，优选为sep-pak c18脱盐柱，waters,cat#:wat023590；所述脱盐柱使用前，用100％甲醇过柱后，加入含0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液，
29、过柱后，再用不含乙腈的0.1vt％甲酸水溶液过柱，以平衡柱子；所述0.1vt％甲酸水溶液的用量，
30、优选地，以蛋白计1mg肽段样品需要1ml 0.1vt％甲酸水溶液进行脱盐；所述含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液的用量，优选地，以蛋白计1mg肽段样品需要1ml含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液进行洗脱肽段。
31、在一些实施例中，步骤(5)中，将步骤(4)得到的脱盐的肽段通过反式液相层析进行层析分馏；将脱盐的肽段用流动相a溶解重悬，进液相色谱仪进行层析分馏，收集得到的各肽段馏分进行干燥；
32、所述反式液相层析利用液相色谱仪进行，液相色谱仪具体的色谱条件如下：
33、色谱柱：c18色谱柱；分馏流动相a：8～12mm甲酸铵水溶液，ph＝9.0；分馏流动相b：含8～12mm甲酸铵的90vt％乙腈水溶液，ph＝9.0；梯度洗脱，具体梯度设计如下：0.01-15分钟，5％-5％流动相b；15-105分钟，5-40％流动相b；105-108分钟，40-65％流动相b；108-110分钟，65-95％流动相b；110-120分钟，95-95％流动相b；流速：1ml/min。
34、在一些实施例中，优选地，步骤(5)中，将步骤(4)得到的脱盐的肽段通过反式液相层析进行层析分馏；将脱盐的肽段用流动相a溶解重悬，进液相色谱仪进行层析分馏，收集得到的各肽段馏分进行干燥；
35、所述反式液相层析利用液相色谱仪进行，液相色谱仪具体的色谱条件如下：
36、色谱柱：c18色谱柱；分馏流动相a：10mm甲酸铵水溶液，ph＝9.0；分馏流动相b：含10mm甲酸铵的90vt％乙腈水溶液，ph＝9.0；梯度洗脱，具体梯度设计如下：0.01-15分钟，5％-5％流动相b；15-105分钟，5-40％流动相b；105-108分钟，40-65％流动相b；108-110分钟，65-95％流动相b；110-120分钟，95-95％流动相b；流速：1ml/min。
37、在一些实施例中，步骤(6)中，将步骤(5)分馏收集得到的肽段样品使用甲酸水溶液重悬，进样液相色谱-质谱联用仪中进行质谱检测，具体的色谱条件如下：
38、液相色谱条件：
39、色谱柱：reprosil purec18-aq，内径为75μm，长度25cm，填充c18微球，c18微球粒径为1.9μm；柱温：50℃；流动相a：含有0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；流动相b：70～80vt％乙腈、0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；梯度洗脱：0～80分钟，5-25％流动相b；80～110分钟，25-40％流动相b；110～115分钟，40％-65％流动相b；115～120分钟，65％-95％流动相b；洗脱时间为120分钟；进样流速为0.3μl/min；
40、质谱色谱条件：
41、使用dda模式采集质谱数据，其参数如下：喷雾电压2.1kv；毛细管温度为320℃；在200m/z处一级全扫描分辨率为60,000，agc target：3e6，maximum ion time：50ms，一级质量扫描范围350-1500；top n：20；在200m/z处二级全扫描分辨率为15,000，agc target：1e5，maximum ion time：105ms，二级扫描fixed first mass 100m/z；碎裂模式为hcd，碎裂归一化碰撞能量(normalized collision energy，nce)为29，动态排除时间为30.0s；
42、质谱原始数据分析是以人源蛋白序列为数据库，搜索参数如下：半胱氨酸上的脲甲基化设置为固定修饰参数；甲硫氨酸上的氧化修饰、蛋白n端的乙酰化修饰设置为可变修饰参数；特异性酶切选择胰蛋白酶，允许的多肽最大漏切数为2。
43、在一些实施例中，优选地，步骤(6)中，将步骤(5)分馏收集得到的肽段样品使用5vt％甲酸水溶液重悬，进样液相色谱-质谱联用仪中进行质谱检测，具体的色谱条件如下：
44、液相色谱条件：
45、色谱柱：reprosil pure c18-aq，内径为75μm，长度25cm，填充c18微球，c18微球粒径为1.9μm；柱温：50℃；流动相a：含有0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；流动相b：80vt％乙腈、0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；梯度洗脱：0～80分钟，5-25％流动相b；80～110分钟，25-40％流动相b；110～115分钟，40％-65％流动相b；115～120分钟，65％-95％流动相b；洗脱时间为120分钟；进样流速为0.3μl/min；
46、质谱色谱条件：
47、使用dda模式采集质谱数据，其参数如下：喷雾电压2.1kv；毛细管温度为320℃；在200m/z处一级全扫描分辨率为60,000，agc target：3e6，maximum ion time：50ms，一级质量扫描范围350-1500；top n：20；在200m/z处二级全扫描分辨率为15,000，agc target：1e5，maximum ion time：105ms，二级扫描fixed first mass 100m/z；碎裂模式为hcd，碎裂归一化碰撞能量(normalized collision energy，nce)为29，动态排除时间为30.0s；
48、质谱原始数据分析是以人源蛋白序列为数据库，搜索参数如下：半胱氨酸上的脲甲基化设置为固定修饰参数；甲硫氨酸上的氧化修饰、蛋白n端的乙酰化修饰设置为可变修饰参数；特异性酶切选择胰蛋白酶，允许的多肽最大漏切数为2。
49、在一些实施例中，进一步优选地，步骤(6)中，质谱原始数据分析是由thermoproteome discoverer 2.5软件搜库处理；swiss-prot蛋白数据库中reviewed人源蛋白序列为数据库，主要搜索参数如下：半胱氨酸上的脲甲基化设置为固定修饰参数；甲硫氨酸上的氧化修饰、蛋白n端的乙酰化修饰设置为可变修饰参数；特异性酶切选择胰蛋白酶，允许的多肽最大漏切数为2。
50、进一步地，本发明公开了一种血浆中蛋白的质谱检测前处理试剂盒，包括：
51、表面活性剂：8～12％ triton x-100；
52、第一血浆沉淀剂：第一聚乙二醇溶液；
53、第二血浆沉淀剂：第二聚乙二醇溶液；
54、白蛋白去除离心小柱：汽巴蓝琼脂糖凝胶柱；
55、第一沉淀蛋白剂：无水乙腈；
56、第二沉淀蛋白剂：三氯乙酸；
57、第三沉淀蛋白剂：三氯乙酸；
58、第一酶解蛋白酶：含有0.020～0.030μg/μl lys-c酶的8m尿素溶液；
59、第二酶解蛋白酶：胰蛋白酶；
60、还原化试剂：1mol/l二硫苏糖醇水溶液；
61、烷基化试剂：0.1mol/l碘乙酰胺水溶液；
62、烷基化反应猝灭试剂：1mol/l二硫苏糖醇水溶液；
63、脱盐柱：c18脱盐柱；
64、脱盐清洗液：0.1vt％甲酸水溶液；
65、脱盐洗脱液：含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液。
66、在一些实施例中，所述第一聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液，peg6000浓度为18～22％g/ml；所述第二聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液，peg6000浓度为30％g/ml；所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液。
67、在一些实施例中，优选地，所述第一聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.4的pbs缓冲液，peg6000浓度为20％g/ml；所述第二聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.4的pbs缓冲液，peg6000浓度为30％g/ml；所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为50mm、ph＝8.5的teab缓冲液。
68、在一些实施例中，优选地，所述质谱检测前处理试剂盒，包括：
69、表面活性剂：10％ triton x-100；
70、第一血浆沉淀剂：peg6000浓度为20％g/ml的聚乙二醇溶液；
71、第二血浆沉淀剂：peg6000浓度为30％g/ml的聚乙二醇溶液；
72、白蛋白去除离心小柱：汽巴蓝琼脂糖凝胶柱；
73、第一沉淀蛋白剂：无水乙腈；
74、第二沉淀蛋白剂：三氯乙酸；
75、第三沉淀蛋白剂：三氯乙酸；
76、第一酶解蛋白酶：含有0.025μg/μl lys-c酶的8m尿素溶液；
77、第二酶解蛋白酶：胰蛋白酶；
78、还原化试剂：1mol/l二硫苏糖醇水溶液；
79、烷基化试剂：0.1mol/l碘乙酰胺水溶液；
80、烷基化反应猝灭试剂：1mol/l二硫苏糖醇水溶液；
81、脱盐柱：c18脱盐柱；
82、脱盐清洗液：0.1vt％甲酸水溶液；
83、脱盐洗脱液：含有0.1vt％甲酸的65vt％乙腈水溶液。
84、在一些实施例中，上述的质谱检测前处理试剂盒，还包括无水乙腈、10vt％三氟乙酸水溶液、无水甲醇、分馏流动相a、分馏流动相b、5vt％甲酸水溶液、液相流动相a、液相流动相b、以及25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液；
85、优选地，所述分馏流动相a为8～12mm甲酸铵水溶液，ph＝9.0；所述分馏流动相b为含8～12mm甲酸铵的90vt％乙腈水溶液，ph＝9.0；所述液相流动相a为含有0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；所述液相流动相b：70～80vt％乙腈、0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水。
86、在一些实施例中，优选地，上述的质谱检测前处理试剂盒，还包括无水乙腈、10vt％三氟乙酸水溶液、无水甲醇、分馏流动相a、分馏流动相b、5vt％甲酸水溶液、液相流动相a、液相流动相b、以及50mm、ph＝8.5的teab缓冲液；
87、进一步优选地，所述分馏流动相a为10mm甲酸铵水溶液，ph＝9.0；所述分馏流动相b为含10mm甲酸铵的90vt％乙腈水溶液，ph＝9.0；所述液相流动相a为含有0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水；所述液相流动相b：80vt％乙腈、0.2vt％甲酸、3vt％dmso，余量为去离子水。
88、具体地，本技术中所述的高丰度蛋白，指在总蛋白提取物或血浆中含量较高的蛋白，一般包括浓度最高的20种蛋白左右，各蛋白浓度范围在1mg/ml左右，它们占据了血浆蛋白成分中的绝大部分，高丰度蛋白具体包括白蛋白、球蛋白、脂蛋白、补体、凝血因子等。
89、有益效果：
90、(1)本发明发现可以通过聚乙二醇(peg6000)可有效沉淀血浆中的球蛋白等高峰度蛋白，再利用已经市售的汽巴蓝(cibacron blue 3g-a)分离出血浆中的白蛋白成分，然后对这些分离出的各组分分别在碱性ph条件下通过反式液相层析(reverse phase liquidchromatography,rplc)进行层析分馏，最后利用液相色谱-质谱联用仪进行质谱检测蛋白进行质谱检测，可有效提高血浆中蛋白的检测深度。通过该方法，可将血浆中蛋白检测量从2946个增加到4073个，蛋白的检测数量有效的提高了38.3％，极大提高了检测深度，可为血浆中一般情况下丰度较低的临床疾病标志物的发现提供可能。
91、(2)本发明利用peg6000可有效沉淀血浆中的部分高丰度蛋白。其中终浓度为10g/ml％的peg6000可将血浆中的球蛋白从31.1g/l降到2.0g/l；脂蛋白(a)可从0.22g/l降到0.01g/l；补体c3和c4分别从0.98g/l和0.28g/l降到0.0g/l。
92、(3)本发明中利用汽巴蓝凝胶柱(cibacron blue 3g-a)可有效滤除血浆peg沉淀后上清中的白蛋白，可将原血浆中的白蛋白从43.6mg/ml降到4.8mg/ml。
1.一种血浆中蛋白的质谱检测前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述白蛋白去除离心小柱为汽巴蓝琼脂糖凝胶柱；所述血浆为人血浆或动物血浆；所述表面活性剂为5％～10％tritonx-100；所述血浆样本与表面活性剂的体积比为9：1；所述聚乙二醇以溶液的形式存在，聚乙二醇溶液中溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液；所述血浆样本与表面活性剂混合得到的混合液与peg6000浓度为18～22％g/ml的聚乙二醇溶液混合，得到含有peg6000浓度为8～12％g/ml的第一混合液；所述另取部分所述的上清a继续加入peg6000浓度为30％g/ml的聚乙二醇溶液沉淀血浆，得到含有peg6000浓度为20％g/ml的第二混合液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述血浆样本与无水乙腈的体积比为1：9；所述上清滤过液a与三氯乙酸的体积比为9：1；所述上清滤过液b与三氯乙酸的体积比为9：1；所述洗涤使用无水乙腈洗涤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别用含有lys-c酶的尿素溶液溶解，沉淀溶解后加入缓冲液和胰蛋白酶进行酶解；酶解结束后向各样品酶解液中加入二硫苏糖醇进行还原反应，反应结束后加入碘乙酰胺进行烷基化反应，反应结束后再加入二硫苏糖醇进行猝灭反应，得到肽段样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液，尿素的浓度为8mol/l；所述含有lys-c酶的尿素溶液中，lys-c酶的浓度为0.020～0.030μg/μl；所述lys-c酶的用量，以各酶解样本起始所需血浆样本计，所述lys-c酶与所述血浆样本的质量体积比为1μg：9μl；所述缓冲液为teab缓冲液，25-50mm，ph＝8.4～8.6；所述的沉淀b、所述的沉淀c、所述的沉淀d、所述的沉淀e分别用含有lys-c酶的尿素溶液溶解，沉淀溶解后加入缓冲液，缓冲液的用量为将体系中的尿素稀释至终浓度为2mol/l；所述胰蛋白酶与所述lys-c酶的质量比为1：1；所述酶解，在室温下酶解12-24小时；所述二硫苏糖醇以水溶液的形式存在，二硫苏糖醇与水混合得到二硫苏糖醇水溶液；所述二硫苏糖醇水溶液与酶解液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为2mmol/l；所述还原反应，反应温度为室温，反应时间为0.75～1.25h；所述碘乙酰胺以水溶液的形式存在，碘乙酰胺与水混合得到碘乙酰胺水溶液；所述碘乙酰胺水溶液与所述还原反应结束后得到的反应液混合后的体系中，碘乙酰胺的终浓度为5mmol/l；所述烷基化反应，反应温度为室温，反应时间为0.5h；所述二硫苏糖醇水溶液与所述烷基化反应结束后得到的反应液混合后的体系中，二硫苏糖醇的终浓度为5mmol/l；所述猝灭反应，反应温度为室温，反应时间为15min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述脱盐柱为c18脱盐柱；所述脱盐清洗液为0.1vt％甲酸水溶液；所述脱盐洗脱液为含有0.1vt％甲酸的60～65vt％乙腈水溶液；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，将步骤(4)得到的脱盐的肽段通过反式液相层析进行层析分馏；将脱盐的肽段用流动相a溶解重悬，进液相色谱仪进行层析分馏，收集得到的各肽段馏分进行干燥；
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，将步骤(5)分馏收集得到的肽段样品使用甲酸水溶液重悬，进样液相色谱-质谱联用仪中进行质谱检测，具体的色谱条件如下：
9.一种血浆中蛋白的质谱检测前处理试剂盒，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的质谱检测前处理试剂盒，其特征在于，所述第一聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液，peg6000浓度为18～22％g/ml；所述第二聚乙二醇溶液，溶质为peg6000，溶剂为ph＝7.3～7.5的pbs缓冲液，peg6000浓度为30％g/ml；所述尿素溶液中，溶质为尿素，溶剂为25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液。
11.根据权利要求9所述的质谱检测前处理试剂盒，其特征在于，还包括无水乙腈、10vt％三氟乙酸水溶液、无水甲醇、分馏流动相a、分馏流动相b、5vt％甲酸水溶液、液相流动相a、液相流动相b、以及25-50mm、ph＝8.4～8.6的teab缓冲液；
