本技术涉及生物基因工程，尤其是涉及一种合成黑色素的重组大肠杆菌及其在织物染色中的应用。
背景技术：
：：1、黑色素(melanin)是一类聚合物，由吲哚和酚类单体聚合而形成的一类独特的生物大分子，广泛存在于生物体内。黑色素具有清除自由基、螯合金属离子、抗氧化和抗菌等特性，在绿色科技、材料、生物医药、化妆品、环境修复等领域具有巨大的应用前景。2、黑色素作为一种安全的、可生物降解的、可持续的天然染料，在纺织工业中可以成功地替代合成染料，因为合成染料对环境有害，一方面，合成黑色素主要是通过化学试剂合成，价格昂贵，另一方面，合成染料在染色过程中产生的大量废水也会对水生生态系统造成环境污染和生态系统破坏。而生物合成黑色素具有成本低、效益高、生态友好等优点，目前已经报道的生产黑色素的菌株主要有链霉菌，假单胞菌，芽孢杆菌，以及某些真菌等。真菌细胞内存在合成黑色素的天然代谢路径，其产量可以达到较高的水平，但发酵周期较长，目前研究最多的是以分离真菌菌株蜜环菌作为发酵对象，125天产量可以达到28g/l左右(javier ribera.scalable biosynthesis of melanin by the basidiomycetearmillaria cepistipes.j agric food chem.2019jan 9；67(1):132-139.)。利用细菌菌株如链霉菌等也可以达到较高的产量，经过培养基优化后，链霉菌在128h可以达到13.7g/l的产量(guo j.high-level production of melanin by a novel isolate ofstreptomyces kathirae.fems microbiol lett.2014aug；357(1):85-91.)。但是过长的发酵周期不但成本高昂，而且容易染菌，因此，使得利用真菌和细菌天然代谢合成黑色素无法得到大规模生产和利用。3、利用代谢工程进行微生物深层次发酵催化具有成本低、产量高、环境友好等优点，是合成黑色素的理想方式。目前，通过关键基因整合技术，将mela基因整合至大肠杆菌基因组非关键基因lac位点，所得工程菌株培养72h后黑色素产量较低，仅约0.8g/l(sabido a.anovel plasmid vector designed for chromosomal gene integration andexpression:use for developing a genetically stable escherichia coli melaninproduction strain.plasmid.2013jan；69(1):16-23.)。此外，外源蛋白在大肠杆菌中存在酶蛋白表达量低，酶蛋白折叠错误等问题，因此促进蛋白表达量、改善蛋白正确折叠，是有效提高表达酶活，将大肠杆菌应用于生物合成高产量黑色素的关键。4、因此，亟需一种合成黑色素产量高的重组大肠杆菌，以应用于织物染色中。技术实现思路1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种合成黑色素的重组大肠杆菌及其在织物染色中的应用。采用本技术构建的重组大肠杆菌能将酪氨酸高效转化合成黑色素，反应48h产量达到4.3g/l；提取纯化的黑色素成功应用于棉织物的染色。2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：3、本技术提供了一种合成黑色素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为：4、将酪氨酸酶编码基因mela整合插入至大肠杆菌基因组中feab、phea、tyrr三个位点中，并向大肠杆菌导入表达dnak、dnaj、grpe的分子伴侣蛋白表达质粒，获得合成黑色素的重组大肠杆菌。5、在本技术的技术方案中，本技术将酪氨酸酶编码基因mela整合插入至大肠杆菌基因组feab、phea、tyrr三个分叉代谢途径的关键酶基因位点使其敲除，在增加mela基因拷贝数的同时，阻断分叉代谢途径流向，使前体代谢物酪氨酸更多流向目标产物黑色素的合成途径；同时导入表达dnak、dnaj、grpe的分子伴侣蛋白表达质粒，促进表达的酪氨酸酶正确折叠、提高酶活。6、一方面基因表达水平决定蛋白合成速率，进而影响异源蛋白的产量。通过基因组整合技术增加目的基因的拷贝数不仅能有效提高基因表达水平及菌株遗传稳定性，本技术选择酪氨酸分叉代谢途径相关的基因作为插入位点，可以阻断酪氨酸分叉代谢流向，促进酪氨酸向黑色素合成反应方向进行积累。另一方面，大肠杆菌中的异源蛋白若无法正确折叠，则会形成不溶性聚集体并滞留在细胞内，最终被细胞壁结合蛋白酶清除。而本技术联合分子伴侣，可以在蛋白分泌过程中辅助蛋白酶正确折叠或是将已变性的蛋白质进行再折叠和装配，避免被蛋白酶降解，能够促进蛋白表达，提高酶活性。7、本技术将酪氨酸酶编码基因mela与分子伴侣蛋白在大肠杆菌内共同表达，48h可以将黑色素的产量提高至4.3g/l，与现有工程菌株相比，可以有效提高黑色素的产量，同时也可以相应缩短发酵周期，提高菌株生产稳定性。8、作为本技术所述合成黑色素的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述feab、phea、tyrr的genebank登录号依次为eck1087、eck2596、eck1319。9、feab编码苯乙醛脱氢酶基因，苯乙醛脱氢酶促进4-羟基苯乙醛向4-羟基苯乙酸转化；phea编码预苯酸脱水酶基因，将预苯丙酸向苯丙酮酸的转化，以上两个基因的缺失均可以积累酪氨酸前体物质4-羟基苯丙酮酸；tyrr是芳香族氨基酸全局调控蛋白，抑制转氨酶，tyrr基因缺失可以解除反馈抑制作用，提高转氨酶的活性。敲除feab、phea、tyrr这三个位点后阻断了酪氨酸分叉代谢途径流向，酪氨酸可以得到积累，进而提高黑色素的合成量。10、作为本技术所述合成黑色素的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述酪氨酸酶编码基因mela的序列如seq id no：1所示。11、优选地，所述酪氨酸酶编码基因mela来源于根瘤菌。酪氨酸酶编码基因mela的genebank登录号为m59289.1。12、所述酪氨酸酶编码基因mela是黑色素合成的限速酶，可以催化酪氨酸合成黑色素。13、作为本技术所述合成黑色素的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述酪氨酸酶编码基因mela整合采用基因整合表达盒进行基因整合；14、所述基因整合表达盒的构建方法，包括以下步骤：15、将带有pj23119启动子的酪氨酸酶编码基因mela通过无缝克隆插入到质粒，得到重组质粒；分别通过pcr扩增将三个整合位点的上游800bp片段、下游800bp片段和重组质粒中的mela基因片段融合，拼接得到mela基因的线性整合表达盒δfeab::mela donor、δphea::mela donor、δtyrr::mela donor。16、优选地，所述质粒包括ps95s质粒。17、作为本技术所述合成黑色素的重组大肠杆菌的优选实施方式，采用crispr-cas9方法，将所述线性整合表达盒δfeab::mela donor、δphea::mela donor、δtyrr::meladonor依次转染至感受态细胞中，最终形成合成黑色素的重组大肠杆菌。18、作为本技术所述合成黑色素的重组大肠杆菌的优选实施方式，编码dnak的基因序列为seq id no：2所示，编码dnaj的基因序列为seq id no：3所示，编码grpe的基因序列为seq id no：4所示。19、dnak，dnaj，grpe基因的genebank登录号依次为eck0014、eck0015、eck2610。20、dnak是依赖atp的hsp70伴侣蛋白，danj和grpe是核苷酸交换因子，协同介导蛋白质折叠。21、采用上述序列的编码基因共表达于大肠杆菌bl21(de3)中，帮助蛋白酶折叠或是将已变性的蛋白质进行再折叠的分子伴侣蛋白，促进蛋白表达，提高蛋白酶表达活性，从而提高黑色素的产量。22、分子伴侣蛋白来自大肠杆菌，分子伴侣蛋白表达质粒中的质粒包括pkje7质粒，还可以为本领域常见的质粒。23、本技术还提供了上述合成黑色素的重组大肠杆菌在合成黑色素中的应用。24、本技术还提供了一种合成黑色素的方法，采用上述合成黑色素的重组大肠杆菌催化酪氨酸转化合成黑色素。25、作为本技术所述合成黑色素的方法的优选实施方式，包括以下步骤：26、1)将上述合成黑色素的重组大肠杆菌的菌体催化酪氨酸；27、2)催化结束后，滴加三氯醋酸，过滤收集沉淀，得黑色素粗产物；28、3)将黑色素粗产物洗涤至中性，然后加入酸溶液进行回流，过滤，制得黑色素。29、具体为：30、将上述合成黑色素的重组大肠杆菌活化后转接至zym培养基中，30℃诱导培养20h，并测量od600。发酵结束后4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mm pb缓冲液重悬菌体，30od/ml。使用细胞破碎仪破碎细胞。向细胞破碎后的缓冲液中添加10g/l的酪氨酸，反应中保证充足的氧气，反应条件：30℃、220rpm。催化黑色素生物合成。生物合成催化反应结束后，向反应液中滴加10％三氯醋酸，酶蛋白和黑色素一起沉降到瓶底，过滤收集沉淀，得黑色素粗产物。再经稀酸、稀碱洗涤后，再用水洗至中性。将洗至中性的黑色素粗制品置于烧瓶中，加适量hcl回流8-20小时，水解其中的蛋白质，放置冷却，过滤出黑色素，用稀碱洗涤，最后水洗至中性，60℃烘干，即得黑色素。31、本技术还提供了上述合成黑色素的重组大肠杆菌在织物染色中的应用。32、将棉或麻等布片放入蒸馏水中润湿浸泡，再将上述制得的黑色素制备成不同浓度的染色液，染料与织物的质量比为20-50％，染色温度为60-85℃，染色ph为1.5-4.5，染色，取出，晾干后水洗，得到初步染色的棉或麻。配置一定浓度固色液，将初步染色得到的棉或麻置入其中浸泡固色，水洗，晾干。33、本技术以l-酪氨酸为底物高效生产黑色素的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌将酪氨酸酶基因分别整合在大肠杆菌基因组中feab、phea、tyrr三个位点，一方面截流以及解除负反馈抑制，增加前提物质l-酪氨酸的供给水平，另一方面整合3个拷贝的mela至基因组，增加了基因的表达量，提高黑色素的合成能力。同时导入分子伴侣蛋白，促进表达的酪氨酸酶正确折叠、提高酶活。34、与现有技术相比，本技术具备以下有益效果：35、本技术提供了一种合成黑色素的重组大肠杆菌及其在织物染色中的应用，本技术将根瘤菌来源的酪氨酸酶编码基因mela整合插入至大肠杆菌基因组中feab、phea、tyrr三个分叉代谢途径的关键酶基因位点使其敲除，在增加mela基因拷贝数的同时，阻断分叉代谢途径流向，使前体代谢物酪氨酸更多流向目标产物黑色素的合成途径；同时导入表达dnak、dnaj、grpe的分子伴侣蛋白表达质粒，促进表达的酪氨酸酶正确折叠、提高酶活，获得的重组大肠杆菌的细胞破碎液能将酪氨酸高效转化合成黑色素，反应48h产量达到4.3g/l；提取纯化的黑色素可以应用于棉织物的染色。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.一种合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为：
2.如权利要求1所述的合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述feab、phea、tyrr的genebank登录号依次为eck1087、eck2596、eck1319。
3.如权利要求1所述的合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述酪氨酸酶编码基因mela的序列如seq id no：1所示。
4.如权利要求1所述的合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述酪氨酸酶编码基因mela整合采用基因整合表达盒进行基因整合；
5.如权利要求4所述的合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，采用crispr-cas9方法，将所述线性整合表达盒δfeab::mela donor、δphea::mela donor、δtyrr::meladonor依次转染至感受态细胞中，最终形成合成黑色素的重组大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的合成黑色素的重组大肠杆菌，其特征在于，编码dnak的基因序列为seq id no：2所示，编码dnaj的基因序列为seq id no：3所示，编码grpe的基因序列为seqid no：4所示。
7.如权利要求1～6任一项所述的合成黑色素的重组大肠杆菌在合成黑色素中的应用。
8.一种合成黑色素的方法，其特征在于，采用如有权利要求1～6任一项所述的合成黑色素的重组大肠杆菌催化酪氨酸转化合成黑色素。
9.如权利要求8所述的合成黑色素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求1～6任一项所述的合成黑色素的重组大肠杆菌在织物染色中的应用。
技术总结本申请涉及生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种合成黑色素的重组大肠杆菌及其在织物染色中的应用。所述重组大肠杆菌为：将酪氨酸酶编码基因melA整合插入至大肠杆菌基因组中feaB、pheA、tyrR三个位点中，并向大肠杆菌导入表达dnaK、dnaJ、grpE的分子伴侣蛋白表达质粒，获得合成黑色素的重组大肠杆菌。本申请获得的重组大肠杆菌能将酪氨酸高效转化合成黑色素，反应48h产量达到4.3g/L，提取纯化的黑色素可以成功应用于棉织物的染色。
技术研发人员：请求不公布姓名,请求不公布姓名,请求不公布姓名,请求不公布姓名
受保护的技术使用者：南京合谷生命生物科技有限公司
技术研发日：技术公布日：2024/11/11
